Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Луд
ными, а величину — — не зависящей от градиента скорости
С
потока.
Клубкообразная молекула нативной ДНК, как об этом свидетельствуют данные по светорассеянию, обладает большими размерами, чем обычный гауссов клубок, образованный гибкой полимерной цепью той же длины. Это является следствием относительной жесткости двойной молекулярной цепи ДНК, не допускающей крутых и частых изгибов. Вместе с тем достаточно длинные отрезки двухнитевой спиральной цепи ДНК обладают гибкостью, что позволяет молекуле ДНК приобрести клубкообразную форму. Такие цепные молекулы называются полу-жесткими. Показатель а в уравнении характеристической вязкости для таких молекул должен иметь промежуточное значе-
Vyd/(flj/i)0
Рис. 9. Зависимость удельной вязкости раствора нативной ДНК от градиента скорости потока
ние между а = 0,5 (гибкие цепные молекулы) и а =1,8 (жесткие палочкообразные молекулы).
Как отмечено Эйгнером и Доти [8], показатель а для ДНК с различными молекулярными весами (от 0,3-106 до 130-106) действительно изменяется в этих пределах (рис. 10). При малых значениях М (0,3 • 106—2 -106) форма молекул ДНК близка к
Рис. 10. Зависимость характеристической вязкости нативной ДНК от молекулярного веса ДНК
палочкообразной (сг = 1,32; К= 1,05 • 10 7). Напротив, при достаточно больших М (от 2 -106) молекулы ДНК приближаются по форме к гауссовым клубкам (а = 0,7; /С=6,9 - 10~5). Для ДНК в промежуточной области (УИ = 0,5 • 106-нЗ • 106) можно пользоваться приближенной формулой, предложенной ранее Доти (а= 1,12; /С= 1Д5 * 10~6 дл/г (24]) ».
При денатурации ДНК, когда разрушается ее вторичная структура и происходит разъединение полинуклеотидных цепей,
1 Все указанные зависимости справедливы для ДНК в стандартном солевом растворе, содержащем 0,15 М NaCI, 0,015 М цитрата Na, pH 7,0.
составляющих двойную спираль ДНК, характеристическая вязкость претерпевает существенное изменение, зависящее от молекулярного веса ДНК и от ионной силы. Так, для денатурированной ДНК Escherichia coli в стандартном солевом растворе в уравнении для характеристической вязкости коэффициент К (4,9 • 10“4) и показатель а (0,55) значительно отличаются от таковых для нативной ДНК в том же диапазоне молекулярных весов (1,45- 10_6 и 1,12, соответственно (18, 24]). Следовательно, однонитевая полимерная цепь денатурированной ДНК не обладает той жесткостью, которая свойственна нативной структуре, и молекула ДНК после денатурации приобретает свойства гауссова клубка с гибкой полимерной цепью. Однако, при уменьшении ионной силы полинуклеотидная цепь денатурированной ДНК вновь приобретает некоторую жесткость за счет электростатического отталкивания отрицательно заряженных фосфатных групп, которое при большой ионной силе экранируется противоионами. Об этом свидетельствует, например, увеличение показателя в уравнении характеристической вязкости денатурированной ДНК от а = 0,55 (см. выше) до> а = 0,91 при уменьшении ионной силы примерно в 15 раз [8].
Этот последний пример показывает, что при изучении растворов нуклеиновых кислот нельзя не учитывать, что эти биополимеры являются полиэлектролитами (то же относится и к белкам). Вследствие наличия большого количества заряженных групп в молекулах белков и особенно нуклеиновых кислот необходимо при всех измерениях сохранять одинаковыми ионные условия, точнее, ионную силу раствора. Только в этом случае можно быть уверенным, что конфигурация молекул при измерениях остается неизменной. В серии измерений с уменьшающимися концентрациями полиэлектролита для определения [ц\ недостаточно сохранять постоянным содержание солей в растворе, так как уменьшение концентрации полиэлектролита ведет к понижению ионной силы — той ее доли, которая создается заряженными группами. Эффективная ионная сила в данном случае остается постоянной при так называемом изоионном разбавлении [25], когда, уменьшая концентрацию полиэлектролита, одновременно увеличивают на некоторую рассчитанную величину концентрацию солей.
2. Метод ультрацентрифугирования
Одним из самых [распространенных и плодотворных методов изучения природных и синтетических полимеров является метод ультрацентрифугирования. Он заключается в создании больших центробежных ускорений, превышающих ускорение земного притяжения в 104—105 раз в роторах, вращающихся со скоростями
до 60 000 об/мин. Под действием таких сильных центробежных полей происходит осаждение (седиментация) молекул растворенного полимера, аналогично осаждению крупных частиц суспензии под действием поля тяготения Земли. При низких ускорениях осаждение частиц молекулярных размеров невозможно вследствие хаотического теплового движения, влияние которого тем больше, чем 'меньше размер частиц.
В случае, когда скорость диффузии за счет теплового движения частиц значительно меньше скорости осаждения под действием центробежного поля, .можно непосредственно измерять скорость седиментации частиц. При этом в растворе, первоначально 'гомогенном, вследствие осаждения частиц образуются две области: область чистого растворителя и область раствора, содержащего исследуемые частицы (для биополимеров растворителями обычно служат солевые и буферные водные растворы). Между этими областями имеется переходная зона (граница), в которой концентрация полимера плавно изменяется от нуля до некоторого максимального значения. Наблюдение скорости '.перемещения этой границы лежит в основе метода скорости седиментации. В реально наблюдаемой переходной зоне концентрация никогда не изменяется резко и зона имеет «конечную ширину. Она размывается, во-первых, вследствие диффузии осаждаемых частиц, во-вторых, за счет поледисперсности препаратов по молекулярному весу в результате осаждения разных частиц с разными скоростями. В этом случае по величине размытия границы возможна оценка степени ,поледисперсности ис-следуемото образца. Важной разновидностью метода скорости седиментации является метод осаждения в градиенте плотности.
