Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
При интерпретации этих явлений нужно иметь в виду прежде всего то, что длительное послесвечение не представляет собой просто процесса «удлинения» или «растяжки во времени» обычной флуоресценции, а является отдельным, самостоятельным процессом, накладывающимся на обычную флуоресценцию и сосуществующим с ней. Это следует из того, что при изучении образцов, обладающих длительным послесвечением, можно при помощи высокочастотного фазового флуорометра, описанного выше, легко выделить в свечении компоненту со значениями т порядка 10~9 сек. Это было бы невозможно, если бы мы имели дело с одной полосой свечения, затухающей как целое с константой порядка долей секунды или целых секунд.
Другой важный факт, обнаруженный впервые Вавиловым и Прингсгеймом [105], заключается в том, что следует различать два вида длительного послесвечения, отличных и по своим кинетическим характеристикам, и по спектрам. При сравнительно высо-
1 Недавно было показано, что длительное послесвечение можно наблюдать и при комнатной температуре в растворах малой вязкости, если их очень тщательно обезгазить и удалить последние следы газов и примесей [104].
Iph
Рис. 45. Спектры суммарного свечения (1), а-полосы (2) и р-полосы (3) [69]
А — раствор трипофлавина в смеси глицерина с глюкозой, * ” —35° С; Б — раствор акридинового оранжевого с оргстекле, t-------------------50° С
кой (комнатной) температуре спектр длительного послесвечения совпадает или почти совпадает со спектром флуоресценции. По мере понижения температуры наряду с этой полосой начинает развиваться вторая, смещенная в длинноволновую (красную) сторону (рис. 45). Следуя Льюису, мы будем называть первую полосу, совпадающую с флуоресценцией, a-полосой длительного послесвечения, а вторую — p-полосой. Иногда просто говорят об а- и р-свечении ’.
Объяснение длительного послесвечения. Синглетная и триплетная система уровней. Объяснение явления длительного послесвечения и указанных выше характерных особенностей этого явления было дано в 1933—1935 г. Яблонским [107], который предположил, что, помимо той системы энергетических уровней, которую мы рассматривали выше (стр. 173), молекулы имеют еще некоторый метаста-бильный, т. е. долгоживущий уровень Т, лежащий несколько ниже первого возбужденного (флуоресцентного) уровня S' (рис. 46).
Метастабильность уровня означает, что вероятность перехода Т —на много порядков меньше, чем вероятность перехода S'^S. Если допустить существование такого уровня энергии, то явление длительного а- и р-свечения получает простое объяснение. Молекула, оказавшаяся в результате поглощения фотона на уровне S', имеет некоторую конечную вероятность (г) перейти без испускания излучения на уровень Т. Эта вероятность сравнима с вероятностью флуоресценции р, т. е. вероятностью перехода S'-^S(p) и вероятностью теплового тушения на уровне S'. Молекула, оказавшаяся на метастабильном уровне, может либо перейти на уровень S с испусканием кванта света меньшей энергии (большей длины волны), чем свет флуоресценции, либо испытать тушение — внутреннюю конверсию энергии возбуждения в тепло, либо, наконец, за счет тепловых флуктуаций снова вернуться на уровень S'. Вероятности этих трех процессов мы будем обозначать соответственно через я, q2 и р, как это указано на рис. 46.
При сравнительно высокой температуре вероятность тушения на уровне Т много больше, чем вероятность излучения р, и мы практически наблюдаем только свечение, соответствующее переходам S'-±S, т. е. флуоресценцию и a-полосу длительного послесвечения. Последняя может наблюдаться только в том случае, если за время возбужденного состояния более или менее значительная доля возбужденных молекул успеет побывать в состоянии Т и вернуться обратно на уровень S'. Для этого необходимо, чтобы
1 Длительное послесвечение органических молекул часто называют их фосфоресценцией. Неправомерность и нелогичность такой терминологии была выяснена выше (стр. 171). К сожалению, однако, этот термин можно довольно часто встретить не только в биологических и химических, но и 3 некоторых физических работах.
вероятность г была достаточно велика по сравнению с суммой p + qь вероятность р достаточно велика по сравнению с n + q2. Условия для этого создаются жесткостью среды.
Вероятность р зависит от температуры и резко уменьшается при значительном ее понижении. Вместе с тем при этом уменьшается и вероятность тушения на уровне Т (величина q2), тогда как вероятность излучения я остается неизменной. В силу этого при низкой температуре более или менее значительное количество молекул, попавших на уровень Т, успевает совершить радиационный переход на основной уровень S прежде, чем они будут потушены. Так возникает длинноволновая p-полоса длительного послесвечения, соответствующая переходам T—>-S.
Рис. 46. Схема Яблонского для объяснения длительного послесвечения
Было показано [106], как по экспериментальным данным можно определить в функции от температуры все шесть вероятностей р, q, г, я, <72 Р. определяющих соотношение между флуоресценцией, длительным послесвечением и тепловым тушением возбужденных молекул.
