Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Причиной того, что среди различных физических методов исследования структуры биополимеров и изучения механизмов основных биологических функций все большую роль начинают играть методы, основанные на изучении характеристик люминесценции, является, с одной стороны, способность многих биологически важных соединений флуоресцировать как in vitro, так и in vivo, а с другой — тот факт, что белки и нуклеиновые кислоты легко образуют комплексы с флуоресцирующими молекулами. Изучение люминесцентных свойств таких комплексов часто позволяет выяснить вторичную структуру и молекулярную морфологию этих биополимеров.
б. Спектры излучения
Уровни энергии сложных молекул. В случае простых молекул колебательные подуровни каждого электронного уровня дискретны, т. е. отделены один от другого конечным интервалом. Поэтому в так называемых полосатых спектрах поглощения и излучения таких молекул каждая электронная поло-
Рис. 23. Схема электронно-колебательных уровней энергии сложных молекул. Жир-ные линии — уровни электронной энергии, г
частоты переходов между которыми обозначены v3J1. Тонкие линии — подуровни колебательной энергии, сливающиеся в сложных молекулах в непрерывную полосу. Распределение молекул по запасам колебатель- „
ной энергии показано справа. Стрелки “-V
вверх — различные переходы в спектре поглощения; стрелки вниз — некоторые из переходов в спектре флуоресценции
са распадается на ряд отдельных узких полосок или линий, соответствующих переходам между разными колебательными подуровнями соответствующих электронных состояний. Изучая разности частот этих линий, мы можем определить разность энергий соответствующих подуровней и тем самым проанализировать характер возможных колебаний атомов в данной молекуле.
В случае сложных молекул положение иное. Уровней колебательной энергии здесь так много и они настолько близки один к другому, что сливаются в одну непрерывную полосу (рис. 23). Поэтому и спектры поглощения и флуоресценции этих молекул имеют вид широких непрерывных полос без всякой определенной структуры или, в некоторых случаях, со слабо выраженной структурой. Обычно спектр поглощения состоит из ряда таких частично перекрывающихся полос. Спектр флуоресценции, как правило, состоит только из одной полосы, соответствующей переходу с первого возбужденного уровня на основной уровень. В пределах каждой полосы коэффициент экстинкции или спектральная интенсивность излучения достигают максимума при некоторых определенных значениях длины волны ^макс и ^шкс, а в обе стороны от максимума значения этих величин плавно падают до нуля.
Спектры поглощения и излучения сложных молекул не обнаруживают структуры не только в растворах, но и в парах этих соединений. Из этого ясно, что причиной бесструктурности этих спектров и соответствующих систем энергетических уровней являются не взаимодействия молекул с растворителем, а
особенности их внутренней структуры, наличие большого числа тесно связанных один с другим типов колебаний атомов в молекуле.
В большинстве случаев тонкая структура спектров поглощения и люминесценции не выявляется даже при очень значительном охлаждении растворов. Именно такого рода молекулы можно в строгом смысле слова считать «сложными». Наряду с этим известен ряд случаев, когда структура, отсутствовавшая при комнатной или более высокой температуре, начинает выявляться при низкой температуре. Такие молекулы называют «полу сложными».
Особый интерес здесь представляют некоторые конденсированные ароматические углеводороды, типичным представителем которых является известное благодаря своему сильному канцерогенному действию соединение 3,4-бензпирен. При охлаждении растворов веществ этой группы в некоторых неполярных растворителях до очень низкой температуры спектр их распадается на ряд очень тонких полосок, почти «линий», дающих возможность проводить вибрационный анализ структуры таких соединений. Это явление, открытое Э. В. Шпольским и потому часто называемое «эффектом Шпольского», несомненно, представляет очень большой интерес для анализа структуры ряда важных биоорганических соединений. Мы не имеем возможности остановиться на этом подробнее и вынуждены отослать читателей к обзорной статье Шпольского [52].
Следует подчеркнуть, что предлагаемая классификация молекул (разделение их на «сложные», «полусложные» и «простые») основана только на указанных спектроскопических различиях и ни в какой мере не характеризует их химической сложности или простоты. В самом деле, с химической точки зрения, нет оснований считать «полусложную» молекулу бензпире-на или дибромметилат-9,9-биакридила более простой, чем «сложные» молекулы таких красителей, как флуоресцеин или акридиновый оранжевый.
Универсальность формы спектров поглощения и флуоресценции сложных молекул. Еще в 1922 г. С. И. Вавилов [53] обратил внимание на то, что форма длинноволновой полосы поглощения сложных молекул имеет универсальный характер и лишь в очень малой степени зависит от индивидуальных особенностей строения молекулы. Если для различных по своему составу и строению молекул построить спектры поглощения, искусственно совместив их максимумы и откладывая по оси абсцисс значения разности Лмакс — А, то спектры эти практически совпадают. Как видно из рис. 24, то же справедливо и относительно формы полосы флуоресценции.
