Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лазуркина Ю.С. -> "Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот" -> 35

Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.

Лазуркина Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот — Наука, 1967. — 343 c.
Скачать (прямая ссылка): fizmetodiisledovaniyabelkov1967.djvu
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 133 >> Следующая

Рассмотрим применение позитивного контрастирования на примере небольших «сферических» вирусов [13]. Каплю суспензии вирусов помещают на покрытую углеродной пленкой сетку. Сетку с пленкой выдерживают в течение нескольких часов в 2%-ном водном растворе уранилацетата, после чего промывают водой. В результате такой обработки центральная часть вирусов, где расположена их нуклеиновая кислота, становится видимой в электронном микроскопе и на микрофотографии выглядит как темное пятно. Если часть уранилацетата после промывания остается на пленке-подложке и окружает исследуемые частицы, создается эффект негативного контрастирования, благодаря чему выявляется и белковая капсула.
«Окрашивание» уранилацетатом было применено для контрастирования отдельных молекул ДНК [21, 50, 51]. Тем или иным способом ДНК наносили на углеродную пленку, поддер-
живаемую сеткой. Сетку с пленкой погружали в 1—2%-ный водный раствор уранилацетата (pH 5). После выдержки в течение различного времени сетку вынимали и промывали водой. Описанная методика выглядит примитивной. Однако ее развитие сделало возможным избирательное окрашивание отдельных нуклеотидов. Этого вопроса мы коснемся в следующем разделе.
г. Исследование молекул нуклеиновых кислот
В связи со спецификой нуклеиновых кислот при приготовлении образцов большре значение наряду с их контрастированием приобретают способ нанесения препарата на подложку и физические свойства этой подложки. Поэтому изложение методики исследования нуклеиновых кислот мы выделили в отдельный параграф.
После высушивания капли разбавленного раствора на кол-лодиевой, формваровой или углеродной пленке нуклеиновая кислота обычно образует большие агрегаты, что делает невозможным исследование отдельных ее молекул. Довольно широко распространен способ нанесения раствора нуклеиновой кислоты пульверизацией на поверхность только что расщепленной пластинки слюды. Чтобы контрастировать молекулы и получить возможность их исследовать в электронном микроскопе, применяют предварительно оттененные реплики. Свежий скол слюды имеет идеально гладкую поверхность, обеспечивающую равномерный фон при оттенении молекул. Нуклеиновую кислоту, растворенную в летучем буфере нужного состава, например ацетатно-аммониевом, при помощи пульверизатора наносят на поверхность слюды (рис. 10, а). После оттенения металлом (рис. 10, б) наносят слой углерода (рис. 10, в). Слюду с нанесенной на нее углеродно-металлической пленкой постепенно погружают в воду, как это 'Показано на рис. 10, г, и пленку отделяют от ее поверхности. Затем уровень воды постепенно понижают, и пленка опускается на сетки, предварительно положенные (на керамическом или металлическом диске с отверстиями) на дно воронки.
При работе с высокополимерной ДНК по описанной методике на микрофотографиях отмечается образование участков с повышенной плотностью, от которых в радиальных направлениях расходятся жгуты и одиночные молекулы (рис. 11). Такое распределение связано с высыханием микрокапли раствора на подложке [10, 21, 50].
Трактуя микрофотографии молекул нуклеиновых кислот, контрастированных оттенением, необходимо принимать во внимание направление оттенения. На этих микрофотографиях направление оттенения не всегда четко видно. Это иногда создает неверное представление о поперечных размерах молекул.
Рис. 10. Методика приготовления предварительно оттененных реплик с препаратов типа нуклеиновых кислот, вирусов, фагов, рибосом и т. п. с использованием в качестве подложки свежего скола слюды
а — нанесение препарата на поверхность слюды; б — оттенение металлом; в — нанесение слоя углерода; г — отделение углеродно-металлической пленки от поверхности слюды; 1 — частицы препарата; 2 — выходное отверстие пульверизатора; 3 — пластинка слюды; 4—источник испаряющегося металла; 5 — слой металла; С — графитовые стержни; 7 — слой углерода; 8 — сетки; 9 — диск с отверстиями; 10—воронка, заполненная водой: 11 — трубка с зажимом
На рис. 12, а, б показаны микрофотографии молекул ДНК, оттененных в различных направлениях по отношению к оси молекул. На рис. 12, а направление оттенения перпендикулярно оси. Длина тени равна примерно 200 А. Учитывая, что отношение длины тени к высоте объекта в данном случае равно 10:1, можно рассчитать диаметр молекулы, который равен примерно 20 Д. На рис. 12, б показан случай, когда направление оттенеиия на большом участке длины почти совпадает с осью молекул. В таких условиях представления о форме и размерах молекулы получить нельзя.
Основным недостатком описанной выше методики является то, что пульверизация может вызвать деградацию молекул иук-
Рнс. 11. ДНК из селезенки крыс. Углеродная реплика с предварительным оттенением сплавом платины с палладием. Отношение длины тенн к высоте объекта 10:1
Рис 12. ДНК из селезенки крыс. Углеродная реплнка с предварительным оттенен нем сплавом платины с палладием. Стрелками показано направление оттенения. Отношение длины тени к высоте объекта 10:1
а — направление оттенения перпендикулярно молекуле; 6 —оттенение произведено почти вдоль молекулы
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 133 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed