Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Оценка характера контрастирования при помощи стереопар носит в известной степени субъективный характер. В дальнейшем эти же исследователи использовали [39] более надежный прием. Они наклоняли образец на угол от 20 до 45°. В этом случае на микрофотографиях одного и того же участка до и после наклона можно было отчетливо обнаружить изменения в изображении частиц (рис. 8). Так как исследовались белковые капсулы вируса папилломы кроликов, характеризуемые икосаэдри-ческой симметрией, то отмечалось перемещение отдельных морфологических единиц (так называемых пентамеров). Зная, как проходит ось вращения образца, можно было определить, какой стороне капсулы эти морфологические единицы принадлежат. Было показано, что там, где получают изображение с одной стороны частицы, эта сторона преимущественно та, которая обращена к подложке. Пропорция частиц, контрастированных с одной стороны, составляла 1%. При этом контрастирование осуществлялось по методике, когда каплю суспензии вирусов наносили на тонкую углеродную пленку, затем наносили 1%-ный раствор ФВК и жидкость отсасывали с края сетки.
Рис. 8. Частица, контрастировавшая негативным методом (а), и схема (б), показывающая, как изменяется на проекции сферы положение какой-либо характерной точки (отмеченной крестиком), расположенной на ее поверхности, в зависимости от изменения направления (А или В) просмотра
] — пучок электронов; 2 — подложка; 3 — контрастирующее вещество; 4 — частица; 5 — фотопластинка
Чтобы иметь возможность легко определить направление оси наклона, на противоположную сторону сетки (т. е. ближайшую к источнику электронов) наносили ВТМ, также контрастнрован-ный негативным методом. И тот, и другой вирусы можно было наблюдать одновременно. Ось поворота была перпендикулярна направлению смещения изображений «верхнего» и «нижнего* вирусов относительно друг друга.
В некоторых случаях наложение изображений различных участков объекта, контрастнрованного негативным методом, друг на друга, приводит к формированию весьма своеобразных картин. Например, при помощи электронной микроскопии было обнаружено, что при реполимеризации белок ВТМ в определенных условиях способен создавать трехмерные кристаллы [47]. На микрофотографиях кристаллов была чаще всего видна решетка с квадратными ячейками. Кристаллы такого же характера, но с другими параметрами решетки были обнаружены и при реполимеризации белка вируса штриховатой мозаики ячменя [48] (рис. 9, а). Анализ микрофотографий позволил установить, что составными частями этих кристаллов, элементами, из которых они построены, -являются диски, образованные из молекул белка вирусов. На рис. 9, б показана схема, демонстрирующая, как именно вфзникает видимость квадратной решетки,
1000/
Рис. 9. Трехмерный кристалл, образующийся при реполимеризацни белка вируса штриховатой мозаики ячменя и схема, демонстрирующая, каким образом создается видимость квадратной решетки
Она образуется благодаря наложению друг на друга изображений белковых дисков, расположенных в объемноцентрироваииой тетрагональной решетке.
Оценивая метод негативного контрастирования, необходимо отметить большую его эффективность, особенно при исследовании вирусов. Преимущество этого метода наглядно демонстрирует сравнение микрофотографий ВТМ, оттененного (см. рис. 3, а, б) и контрастированиого ФВК. (см. рис. 7, б, е) [8]. Если в первом случае детали строения капсулы обнаружить ие удается, то негативное контрастирование выявляет в капсуле внутренний канал и белковые субъединицы, из которых она построена.
Реальность выявляемых при помощи негативного контрастирования структур прекрасно подтверждается данными, полученными другими методами (например, рентгеноструктурным анализом, электронной микроскопией оттененных и «окрашенных» вирусных частиц). Из экспериментов с вирусом герпеса, адено1 вирусом, миксовирусами видно, что они не теряют инфекционное™ после смешивания с ФВК. Электронная микроскопия вируса герпеса [38] показала некоторое разрушение капсулы вируса только при очень низких значениях pH ФВК — 4,2. Известно также [44], что белки, высушенные в каплях ФВК и затем снова увлажненные, в большинстве своем не деструктированы, не нарушается их ферментативная активность. Вместе с тем влияние взаимодействия ФВК с отдельными молекулами белка установлено еще недостаточно. Недавно опубликована работа, в которой спектрофотометрически и при помощи аналитического центрифугирования исследовали взаимодействие ФВК с молекулами гемоглобина [49]. Оказалось, что при pH 5—7 ФВК сильно взаимодействует с гемоглобином, о чем свидетельствуют быстрое увеличение коэффициента седиментации и резкий спад поглощения. В области pH 7—9,5 это взаимодействие меньше, но молекулы заметно агрегируют.
Позитивное контрастирование. За последние годы получило широкое распространение избирательное «окрашивание» срезов водорастворимыми слоями тяжелых металлов с целью выявления участков, занимаемых нуклеиновой кислотой. Физическая сущность такого окрашивания заключается в присоединении ионов тяжелых, сильно рассеивающих электроны металлов к молекулам нуклеиновой кислоты. Успехи, достигнутые в этой области, вызвали применение аналогичных методов окрашивания к вирусам [13], рибосомам [40] и отдельным молекулам нуклеиновой кислоты [21, 50, 51]. Как мы уже упоминали, такое контрастирование иногда называют позитивным.
