Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Аналитический ротор имеет обычно два отверстия-гнезда для аналитической кюветы и ее противовеса диаметром ^2,5 см. Расстояние от оси вращения до центра кюветы, как правило, равно 6,5 ем. Противовесом является дюралюминиевый цилиндр с осевой резьбой и сменными винтами, подбором которых производится уравновешивание кюветы. В противовесе имеются два отверстия, расположенные на известных расстояниях от центра ротора, которые в регистрирующих системах ультрацентрифуг используются как отсчетные расстояния для нахождения
16 Физические методы исследования белков
241
Рис. 11. Основные типы роторов а — угловой ротор с пробирками; б — ротор с откидными стаканами (swing-out или bucket-rotor); в — аналитический ротор
истинных положений точек рабочей части кюветы относительно оси вращения. Аналогичное отверстие имеется в теле ротора на случай, если вместо противовеса используется вторая аналитическая кювета. Основные типы роторов изображены на рис. П.
Аналитическая кювета состоит из дюралюминиевого корпуса, вкладыша, имеющего сквозной секториальный резервуар, и ква-рцевых окошек. Высота вкладыша варьирует от 2 до 30 мм. Вкладыш кюветы делается из дюралюминия или из химически стойкой пластмассы. Кювета герметизируется при помощи колец с резьбой, прижимающих кварцевые окошкн к вкладышу кюветы через полиэтиленовые прокладки. Вкладыш имеет отверстие
Рис. 12. Схема аналитической кюветы и ее элементов / — кварцевое окошко; 2—уплотнительная прокладка; 3 — держатель кварцевого окошка; 4 — шпонка; 5 — корпус; С — боковой винт; 7 — прокладка: 8 — вкладыш; 9 — резьбовое кольцо
для залнвки раствора в кювету, которое уплотняется через полиэтиленовую прокладку нарезным штифтом, ввинчиваемым в корпус кюветы. Таким образом, рабочее пространство кюветы ограничено секториальным резервуаром и кварцевыми окошками. Плоскости боковых стенок резервуара пересекаются на оси вращения 1ротора (рис. 12). Такая форма резервуара обеспечивает прямолинейность траектории седиментнрующих частиц в любой точке рабочего пространства.
Кроме описанной кюветы существует ряд разновидностей, широко применяющихся в практике (подробно см. обзор Шах-мана [27]). Рассмотрим две наиболее важные конструкции.
1. Двухсекторная кювета имеет во вкладыше два независимых резервуара, в один из которых заливается исследуемый раствор, в другой — чистый растворитель (рис. 13). При оптической регистрации результатов аналитического опыта, выполняе-мо-го с односекгорной ячейкой, часто бывает трудно определить положение отсчетной линии (см. рис. 15), отвечающей чистому растворителю, поскольку она бывает искривленной вследствие
перераспределения концентрации солей в растворе. Одновременная регистрация кривых, соответствующих чистому растворителю и раствору, содержащему исследуемое вещество, как это может быть сделано с двухсекторной кюветой, устраняет эту трудность. Применение двухсекторной кюветы позволяет также обнаружить небольшие примеси, сопровождающие основной компонент исследуемого раствора (см. рис. 16), и повышает точность отсчета результатов.
2. Кювета с искусственной границей состоит нз двух сообщающихся через капилляры резервуаров — рабочего и вспомогательного. Кюветы этого типа позволяют получить узкую границу между исследуемым раствором и чистым буферным раствором посредством наслоения буфера на исследуемый раствор и, наоборот, подслоением раствора под буфер в зависимости от конструкции кюветы. На рис. 14 приведено схематическое изображение вкладыша кюветы с наслоением. Последнее происходит при скорости ротора 7000—8000 об/мин по капиллярам, которыми служат риски на торце вкладыша. Кюветы с искусственной границей используются для определения коэффициента седиментации низкомолекулярных веществ, коэффициента диффузии, при изучении взаимодействующих компонент и т.'д.
Рис. 13. Вкладыш двух-сскторной кюветы
Рис. 14. Вкладыш кюветы для создания искусственной границы наслоением
Рис. 15. Седиментационная диаграмма для определения истинного положения базовой линии раствора сывороточного альбумина в 2,0 М NaCl. слева — обычная кювета, справа — двухсекторная. Искривление базовой линии обусловлено перераспределением концентрации NaCl в растворе [27]
Рнс. 16. Седиментационная диаграмма для раствора сыворотрч-ного альбумина, слева — обычная кювета, справа — двухсекторная. Четко видно наличие примеси с -правой стороны седи-ментацнонпой кривой [27]
Для определения скорости перемещения границы или перераспределения вещества в кювете необходимо регистрировать изменение концентрации раствора в различных частях кюветы. Существует однозначная связь концентрации вещества с показателем преломления раствора и его оптической плотностью. Этим определяется выбор соответствующих оптических методов регистрации при аналитическом ультрацентрифугировании.
М етод Фильпота — Свенссона (метод шлирен-диафрагмы)
dti
[5]. Этот метод позволяет регистрировать производную — коэффициент
