Биохимия мембран. Рецепторы клеточных мембран. Том 4 - Кульберг А.Я.
Скачать (прямая ссылка):
предварительного выделения их в высокоочищепном виде. Идентификация
рецепторного белка в препаратах клеточных мембран или непосредственно на
клеточной поверхности может быть осуществлена за счет связанного им
радиомеченого лиганда. Если использовать лиганд, способный ковалентно
при-
и
соединяться к рецептору, возникнут благоприятные возможности для
идентификации рецепторного белка среди других солюбилизированных
мембранных белков.
Ковалентное присоединение лиганда к рецептору основано на методе метки по
сродству (affinity labelling), разработанной первоначально для антител и
ферментов (A. Wofsy et al., 1963). Метод состоит в следующем. Лиганд,
содержащий реакционноспособную группу, после связывания в активном центре
рецептора (антитело, фермент) взаимодействует с одним из боковых Рис. 2.
Метод метки по сродству аминокислотных остатков в района примере
фиксации в активном не активного центра с образова-
центре антитела против дннитро- Нием ковалентной связи (рис. 2).
фенильнои группы специфичного Одна из изящных модифика-
лиганда
цин метода метки по сродству со-стоит в получении фотоактивного лиганда.
После связывания лиганда с бечком лиганд подвергается фотолизу, в
результате которого появляется реакционноспособная группа,
взаимодействующая с аминокислотными ос-, татками в районе активного
центра. В качестве примера такого фотоактивного соединения можно привести
2-[4-(4-азид-3-иод-
бензоил) пиперазин-1-1]-4-амино-6,7-диметоксиквиназолнн. Указанное
соединение является аналогом празозина - специфического ai-
адренергического антагониста. Оно специфически взаимодействует с ai-
адренергическим рецептором, блокируя его активный центр. Использование
фотоактивного лиганда, меченного 1251, позволяет в дальнейшем
идентифицировать как комплекс лиганд - рецептор, так и отдельные
субъединицы рецептора с ковалентно фиксированным на них лигандом (Н. Hess
et al., 1983; С. Е. Seidman, 1984).
Другим примером использования реакционноспособных соединений для
маркирования рецепторов могут служить экспери-
Осгатк
тирозина
12
менты с рецептором прогестерона на клетках матки человека (J. С. Warren,
1971-1975). В этих исследованиях использовали радиомеченые 11а- и 16а-
бром [2'-3Н] ацетокиспрогестерон. После связывания в активном центре
рецептора лиганд взаимодействовал с остатками гистидина и метионина в
активном центре, образуя с ними ковалентные связи.
/ч^ЛЛ^РецеПТ°Р с=с-сн2 с=с
N^s. JV N^s. .N-*СНХО-Прогестерон
\н __________^_________" С ~ II
Вг*СН2СО-Прогестерон И
Остаток || О
гистидина 0
Возможности метода метки по сродству для изучения строения и функций
клеточных рецепторов весьма велики. Большое разнообразие
реакционноспособных (в том числе фотоактивных) соединений позволяет
использовать их для получения модифицированных лигандов различного
строения и размеров. С их помощью можно получать также
реакционноспособные пептиды и белки. В последнем случае необходимо иметь
производное с реакционноспособной группой, присоединенной к строго
определенному аминокислотному остатку. В качестве примера такого
производного можно привести инсулин быка, остаток лизина которого в В-
цепи модифицирован Ы-[Ы'-(2-нитро-4-азидфенил)-глицином]. Такое
производное инсулина нашло применение для маркирования рецепторов гормона
на жировых клетках (адипо-циты) (В. С. Reed et al., 1983, 1984).
1.3. Молекулярная масса и пространственная структура рецепторов
В табл. 1 приведены сведения о молекулярных характеристиках рецепторов
ряда гормонов и других лигандов. Хотя строение некоторых рецепторов
изучено в недостаточной степени, общее заключение может быть сделано. Как
правило, рецепторы имеют большую молекулярную массу и достаточно часто
состоят из нескольких субъединиц (полипептидные цепи). Молекулярная масса
рецепторов колеблется в широких пределах и не зависит от природы и
молекулярной массы лиганда. Рецепторы одного н того же лиганда,
экспрессируемые различными клетками, могут заметно различаться по
структурной организации. Это относится, например, к рецепторам инсулина
на аднпоцнтах и клетках мозга, а также к рецепторам соматостатина на
клетках мозга и поджелудочной железы. Различия в структурной организации
как сходных, так и разных по специфичности рецепторов могут быть связаны
с различиями в строении не всей молекулы, а лишь од-
13
Таблица I. Молекулярные характеристики клеточных рецепторов
Рецептор Молеку- лярная масса, кД Число субъединиц и кх
молекулярная масса, кД Дисульфид ные связи между полипеп-тидными цепями
Углеводны it компонент Источник рецептора
Инсулина 350 2'+2 ((Х2Р2) а-130; р- 90 + + Адипоциты
Эпидермального фактора роста 90 131 - + Клетки карциномы
человека
Трансферина 186 2 (димер) + + Ретнкулоциты овцы
Тиротропина 200 2+2 (б2е2) е-35; 6-66 + (между е-цепями) +
Щитовидная железа свиньи
Хорион-гонадо- тропина 240-280 2+2 ("2Р2) (х-85; Р-38 + (между а- и р-
цепями) + Желтое тело яичника коровы
