Биохимия мембран. Рецепторы клеточных мембран. Том 4 - Кульберг А.Я.
Скачать (прямая ссылка):
нелимфоидных клетках рецепторы, способные распознавать простые по
строению гаптены, и изучить строение активных центров таких рецепторов,
сопоставив его со строением активных центров антитела к тому же простому
гаптену.
В последнее время такие работы были проведены с использованием в качестве
клеток-мишеней покоящихся перитонеальных макрофагов и одного из клонов
(P388D!) трансформированных макрофагоподобных клеток мыши (А. Я. Кульберг
и др.,
1985), а также клонированных костно-мозговых фибробластов кролика (JI. М.
Бартова и др., 1987). Осуществляли поиск и последующее изучение
рецепторов указанных клеток, распознающих такие простые гаптены, как р-
азофениларсанилаттирознн (АРС) н е-динитрофениллизин (ДНФ).
Клетки культивировали in vitro в среде, содержащей меченные по углероду
глицин или лизин. Как правило, использовали клетки, полученные через 72 ч
от начала культивирования с радиоизотопом. В большинстве экспериментов
изучали внеклеточные участки (домены) рецепторных белков, для изоляции
кото-
1 См.: Кульберг А. Я. Иммуноглобулины как биологические регуляторы. М.,
1975. С. 50-53.
53
5
с
5
и
о
S
h
Ьй
сз
С
?
3
С-
рых с помощью протеолиза кратковременно инкубировали клетки при 37°С с
трипсином. Протеолиз прекращали добавлением соевого ингибитора трипсина.
Другой способ солюбилизации рецепторов (включая рецепторы к простым
гаптенам) состоял в обработке клеток неионным детергентом нонидетом Р-40.
С целью
обнаружения в составе "снятых" с поверхности клеток (с помощью трипсина)
фрагментов белков, реагирующих с упомянутыми гаптена-ми, использовали
метод аффинной хроматографии, для чего АРС, ДНФ или взятый для сравнения
гомологичный (неиммунный) IgG кролика иммобилизовали па бромциансефа-
розе. Аналогично вели поиск специфичных к упомянутым соединениям
клеточных белков в материале, солюбилизированном неионным детергентом.
Выполненные эксперименты показали, что макрофаги, клетки линии P388Di и
фибробласты из костного мозга синтезируют мембраносвязанные белки,
взаимодействующие с иммобилизованными АРС, ДНФ и IgG. Связывание носило
специфический характер, что можно проиллюстрировать данными, полученными
в опытах с фибробластами (рис. 11).
Порцию материала, "снятого" с фибробластов с помощью трипсина, пропускали
через колонку, содержащую иммобилизованный АРС. Другую порцию того же
материала пропускали последовательно через колонки с иммобилизованным
IgG, а затем иммобилизованным АРС. Полноту сорбции на каждом сорбенте
контролировали. Оказалось, что при пропускании только через
иммобилизованный АРС и при последовательном пропускании через
иммобилизованные IgG и АРС количество радиоактивности, связавшееся с АРС,
было одинаковым. Следовательно, IgG не связывает материал, фиксирующийся
на АРС.
Аналогичные эксперименты были выполнены с материалом, "снятым" с помощью
трипсина с макрофагов и клеток линии P388D]. В этих случаях
последовательно пропускали материал через АРС и ДНФ или только через один
из сорбентов. Количе-
Щ арс
^ IgG кролика ? Анти-АРС
Анти-анти-АРС
Рис. П. Гаптенсвязывающие структуры, экспрессируемые фибробластами из
костного мозга кролика:
стрелкой показана последовательность пропускания пробы через различные
иммуносорбенты; ниже оси абсцисс-остаточная радиоактивность,
связывающаяся с иммобилизованным АРС, после пропускания проб через
соответствующие иммуносорбенты, остальные пояснения см. в тексте
54
¦ство радиоактивности, связавшееся при пропускании через один или
последовательно два различных сорбента, было сходным.
В других опытах о присутствии на поверхности макрофагов рецепторов для
простых гаптенов судили по специфичности связывания этими клетками
изологичного белка (IgG), боковые аминокислотные остатки которого (лизин)
были модифицированы с помощью динитрофторбензола. Такой антиген с ДНФ-
груп-
2а?
О
н
"и
с;
2*
S
5
с
5
S
л
н
U
о
X
т
X
н
ъс
я
о
X
П
я
5000
4000
3000
2000
1000 L
1 1
10 8 10 7
10
-6
Концентрация гаптена, М
Концентрация гаптена, М
Рис. 12. Влияние простых гаптенов на связывание (Л) и поглощение
(Б) макрофагами динитрофенилированного изологичного IgG (антиген):
1 - в присутствии АРС, 2 - в присутствии ДНФ; заштриховано связывание
(поглощение) антигена клетками в отсутствие гаптенов
нами связывался на холоду макрофагами и поглощался ими при 37ЭС (для
оценки этих процессов входящий в антиген IgG метили с помощью 1251). В
присутствии гомологичного гаптена (ДНФ) связывание указанного антигена
клетками резко подавлено. а фагоцитоз вообще не происходит.
Гетерологичный гаптен (АРС) никакого влияния на связывание и поглощение
ДНФ- IgG не оказывает (рис. 12).
Приведенные выше данные указывают на то, что нелимфоидные клетки
различного происхождения синтезируют мембранные белки, специфически
взаимодействующие с простыми гаптенами. К этим гаптенам без труда могут
быть получены антитела, способные специфически их распознавать. С целью
