Биохимия мембран. Рецепторы клеточных мембран. Том 4 - Кульберг А.Я.
Скачать (прямая ссылка):
по набору рецепторов. Наряду с идентичными по функциям рецепторами,
которые необходимы для обеспечения жизни любой клетки, обнаруживаются
также рецепторы,
6
характерные для специализированных клеток. Именно эти рецепторы отражают
особенности дифференцировки данной к тетки в онтогенезе.
Существование в одном органе различных по происхождению клеток (например,
энтодермального и мезодермального происхождения) или клеток единого
происхождения, но различной специализации (как Т- и В-лимфоциты) диктует
необходимость их функциональной кооперации. Она достигается при участии
разнообразных медиаторов и клеточных рецепторов. В этом случае
ответственные за кооперативное взаимодействие клеток рецепторы "работают"
сообща, обеспечивая выполнение функции, характерной для данного органа
или клеточной системы в целом.
Биосинтез клеточных рецепторов контролируется различными индукторами, в
числе которых находятся как содержащиеся во внешней среде специфические
лиганды, так и другие по строению и функции лиганды. Плотность рецепторов
определенной специфичности на клеточной мембране отражает ее способность
выполнять функцию, контролируемую данным лигандом. Поэтому определение
содержания в организме какого-либо биологически активного соединения
(например, гормона) не дает достаточной информации для того, чтобы судить
о его функциональной активности до тех пор, пока не будет установлена
плотность рецепторов данного гормона на клеточных мембранах.
Таким образом, изучение клеточных рецепторов может претендовать на
необходимую глубину лишь при одновременном исследовании соответствующих
лигандов и реакций лиганд - рецептор. Следует также иметь в виду, что
рецепторы служат интегральными компонентами биологических мембран, в силу
чего их взаимодействие с лигандами приводит к ряду кооперативных
процессов, изменяющих в конечном счете состояние мембраны '. Значимость
этих процессов для механизма функционирования рецепторов рассматривается
в этой книге.
1 См.: Болдырев А. А. Введение в биохимию мембран. М., 1986.
Структурная организация и основные функции клеточных рецепторов
1.1. Выделение и очистка рецепторов
Клеточные рецепторы принадлежат к числу мембранных белков. Участок
молекулы рецептора, пронизывающий цитоплазматическую мембрану, построен
из неполярных аминокислот, в силу чего между ним и липидными компонентами
мембраны осуществляются гидрофобные взаимодействия. Помимо них
рецепторные белки образуют в ряде случаев ковалентные сложноэфирные связи
с остатками фосфорной кислоты фосфолипидов мембраны (рис. 1). Тесная
связь рецепторного белка с клеточной мембраной диктует необходимость
использования для выделения рецепторов солюбилизирующих мембрану
детергентов. С целью дополнительной очистки в ряде случаев прибегают к
удалению из препаратов рецепторных белков ковалентно присоединенных к ним
компонентов клеточной мембраны.
Процедуру выделения рецепторов начинают с получения препаратов клеточных
мембран. Для разрушения клеток используют различные методы, включая
механические, осмотические или температурные (замораживание -
оттаивание). В буферные растворы добавляют ингибиторы протеиназ, чтобы
предотвратить расщепление рецепторов в ходе их выделения. Во многих
случаях для этих целей применяют ингибиторы белковой природы - соевый
ингибитор трипсина, трасилол и др. Солюбилизацию клеточных мембран
осуществляют, как правило, с применением неионных детергентов.
Методы очистки рецепторов основаны па технике аффинной хроматографии. В
качестве специфических сорбентов применяют иммобилизованные на сефарозе
лиганды. Ниже кратко изложены несколько методических процедур, дающих
представление о технике очистки ряда рецепторных белков.
Рецептор трансферина. Трансферин - белок, участвующий в транспорте железа
(см. рис. 1). Рецепторы этого белка можно обнаружить на мембране
практически всех пролиферирующих клеток млекопитающих. Удобным источником
для получения это-
8
го рецептора служат клетки множественной миеломы человека или клетки
перевиваемой плазмацитомы мышей. Клетки лизи-руют в нейтральном буферном
растворе, содержащем неионный детергент - 2% нонидет Р-40 (тритон Х-100),
трасилол и мопо-йодацетат. Лизат первоначально центрифугируют при 800 ^
для
удаления крупных частиц, а затем при 100 000 g для осаждения клеточных
гранул. Для извлечения рецептора из лизата можно использовать трансферин,
иммобилизованный на бромциансефа-розе. Связывание рецептора с лигандом
происходит в ацетатном буфере (pH 5 0), содержащем 0,5% тритон Х-100 и
соли Fe. Элюцию молекул рецептора осуществляют 0,1 М бикарбонатным
буфером -(pH 7,8), содержащим 0,5% тритона и соли Fe (van
I. R. Driel, 1984).
Рецепторы тиротропина. Гормон тиротропин представляет собой гликопротеин,
продуцируемый клетками передней доли
9
гипофиза. Рецепторы гормона экспрессируют клетки щитовидно" железы. Для
очистки рецептора используют частично очищенные клеточные мембраны
