Биохимия мембран. Рецепторы клеточных мембран. Том 4 - Кульберг А.Я.
Скачать (прямая ссылка):
с тем участки молекул иммуноглобулинов, отвечающие за их эффекторные
функ-
л* 43
ции, различаются между собой. Реализация эффекторных функций
иммуноглобулинов (антитела) связана с конформационной перестройкой их
молекул, происходящей в результате связывания лиганда в активном центре
молекулы антитела. Наконец, что весьма существенно, иммуноглобулины
способны выполнять функции клеточных рецепторов у определенной категории
лимфоцитов - так называемых В-клеток. В этой и последующих главах при
рассмотрении вопросов, связанных со строением внеклеточных участков
клеточных рецепторов и происхождением генов, кодирующих лигандсвязывающие
участки рецепторов, будут приведены данные в пользу сходства на
структурно-генетической основе активных центров рецепторов и антител.
Однако прежде необходимо рассмотреть основные методические принципы
изучения строения активных центров рецепторов.
3.1. Принципы исследования активных центров рецепторов
Локализация активного центра. С помощью протенназ, имеющих оптимум
действия в нейтральной среде (например, трипсин), можно расщепить
молекулу изолированного рецепторного белка на несколько функционально-
активных доменов. В гл. 2 приведены результаты подобного исследования,
выполненного на рецепторе эпидермального гормона роста. Кратковременная
обработка самых разнообразных клеток трипсином позволяет отщепить
внеклеточные участки рецепторов различной специфичности. При этом не
происходит разрушения активного центра, расположенного в пределах этого
участка, что позволяет с использованием иммобилизованного лиганда
изолировать внеклеточные участки рецепторов данной специфичности.
В том случае, когда рецептор построен из нескольких субъединиц,
необходимо установить вклад каждой из них в формирование активного
центра. Для этого производят разделение субъединиц изолированного
рецептора, прибегая при необходимости к восстановлению межсубъединичных
дисульфидных связей. Подобный анализ, выполненный, например, на
инсулиновом рецепторе, показал, что за связывание гормона отвечает а-
субъ-единица, в то время как (3-субъединица какого-либо вклада в этот
процесс не вносит (см. гл. 1).
Так как рецепторы содержат в своем составе как углеводные, так и липидные
компоненты, представляется необходимым установить роль углеводов и
липидов в проявлении лигандсвязыва-ющих свойств рецептора. Для этого
прибегают к отщеплению углеводного компонента с помощью ферментов и (или)
обработке очищенных препаратов рецептора органическими растворителями.
Таким путем был установлен существенный вклад олигосахаридов,
содержащихся в молекуле рецептора дтя третьего компонента комплемента
(СЗ), в связывании этим рецептором
44
лиганда - активного^фрагмента СЗ (СЗЬ). Обрабатывая лимфоциты с помощью
нейраминидазы и проназы, удалось показать, что экспрессируемый этими
клетками рецептор агглютинина фасоли представляет собой, видимо,
гликолипид либо гликолипо-протеин (Е. Turpin et al., 1984). В свою
очередь удаление фосфо-липидного компонента Fc-рецепторов макрофагов
путем обработки очищенных препаратов рецептора с помощью анионного
детергента приводило к утрате рецептором способности связывать IgG (М.
Itonaga et al., 1984).
Сведения об инактивации рецептора после удаления его углеводного и
липидного компонентов не могут служить достаточным основанием для
заключения, что именно эти компоненты отвечают за лигандсвязывающие
свойства рецептора. Вероятно, эти данные означают, что небелковые
компоненты рецептора существенны для поддержания такой конформации его
молекулы, которая необходима для обеспечения пространственной доступности
активного центра для лиганда. Что касается собственно активного центра,
то он, как правило, формируется полипептидной цепью (цепями) молекулы
рецептора и находится в N-концевой части рецепторного белка.
Идентификация аминокислотных остатков в активном центре. С этой целью
используют метод метки по сродству (см. гл. 1). Препараты рецепторов
должны быть высокоочищенными. Лиганды с хорошо изученной структурой
модифицируют с таким расчетом, чтобы они образовывали в активном центре
рецептора ковалентные связи с боковыми аминокислотными остатками отрезков
цепи, формирующих центр. Чаще других используют бромацетильные
производные и фотоактивируемые производные лигандов. Доказательством
фиксации лиганда именно в активном центре служит факт необратимого
блокирования им центра, препятствующего связыванию немодифицированного
меченого лиганда.
В качестве примера подобного исследования можно привести эксперименты по
фиксации 11а- или 16а- (бромацетокси) прогестерона в активном центре
рецептора этого гормона, полученного в очищенном виде из клеток матки
человека (S. Holmes, R. Smith, 1983). После модификации рецептора с
помощью лиганда производили гидролиз белка и определяли, с какими
аминокислотами связан гормон. Производное 1 la-прогестерона оказалось
связанным с гистидином, а производное 16а-прогестеро-на - и с гистидином,
