Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) - Кудряшов Ю.Б.
ISBN 5-9221-0388-1
Скачать (прямая ссылка):
Реакции ионов и радикалов формируют различные типы структурного поражения молекул. Если исследуемые молекулярные структуры входят в состав биологических систем, то их повреждение может повлечь за собой такие нарушения в этих системах, которые могут стать проявлением биологического эффекта облучения. Если процессы, происходящие на химической стадии, заканчиваются в первые 10~6-ИГ3 с после облучения, то биологическая стадия может длиться от нескольких секунд до многих лет (например, вызванное облучением уменьшение средней продолжительности жизни млекопитающих).
4.3. Химическая стадия
4.3.1. Структурные повреждения, возникающие в облученных
макромолекулах
Повреждения, возникающие в структуре облученной макромолекулы, могут привести к изменению ее биологических свойств. Поэтому важнейший этап биофизического анализа механизмов инактивации макромолекул ионизирующим излучением состоит в выявлении всех типов структурного повреждения молекул, выяснении природы процессов, приводящих к данному типу повреждения, и в установлении причинно-следственной связи между типом структурного повреждения и характером изменения биологических свойств макромолекулы. Эти вопросы изучены все еще недостаточно.
150
Гл. IV. Прямое действие ионизирующих излучений
Анализ структурных повреждений, возникающих в облученной макромолекуле, представляет сложную экспериментальную задачу, требующую использования высокочувствительных методов исследования.
Структурные повреждения, выявляемые в облученных нуклеиновых кислотах. При облучении сухих препаратов ДНК возникает ряд структурных повреждений, которые удается количественно оценить, как правило, при использовании высоких доз излучения, порядка 104 Гр. Это значительно превосходит значение дозы для различных типов инактивации. Не исключено, что в действительности инактивация нуклеиновых кислот возникает в результате единичных повреждений, например вследствие разрушения нескольких нуклеотидов. Однако ни одним из современных методов анализа не удается прямо, не прибегая к расчетам и экстраполяции, обнаружить столь незначительные повреждения среди десятков тысяч нуклеотидов, составляющих псшинуклеотидную последовательность ДНК или РНК.
Для выявления структурных повреждений нуклеиновых кислот, сопровождающихся изменением их размеров, используют различные методы измерения молекулярной массы облученного препарата (се-диментационный анализ, изменение светорассеяния, осмоса, характеристической вязкости и т.д.), так как молекулярная масса ДНК или РНК изменяется вследствие разрыва полимерной цепи (двунитевого в случае ДНК) или из-за возникновения сшивок между молекулами.
Если разрыв произошел только в одной из цепей ДНК, то снижение молекулярной массы выявляется после щелочной денатурации или нагревания до 90°.
Количественно число однонитевых разрывов определяют с помощью фермента фосфомоноэстеразы, который отщепляет неорганический фосфат от всех концевых монофосфоэфирных групп по местам разрывов, а количество отщепившегося фосфата измеряют фотометрически.
Влияние облучения на состояние системы водородных связей в молекуле ДНК оценивают по возникновению в ней участков денатурации, например, сопоставив количество кислоты, необходимое для денатурации нативной и облученной ДНК при электрометрическом титровании.
Один из способов определения меры денатурированности ДНК основан на использовании гипёрхромного эффекта, свойственного процессу денатурации. Так, коэффициент оптического поглощения нативной ДНК.примерно на 30% ниже, чем для одиночной цепи ДНК или смеси равного по содержанию в ней количества соответствующих нуклеотидов, возрастание коэффициента оптического поглощения облученной ДНК указывает на ее денатурацию.
Еще однн метод выявления денатурированных участков основан на хроматографическом отделении неповрежденных молекул от молекул, имеющих денатурированные участки.
4. Последовательность стадий прямого действия радиации
151
3 7
СХ о
J_____L.
12 3
Доза облучения, х 104 Гр
Коэффициент седиментации 5
Рис. IV. 13. Зависимость образования однонитевых (i?i) и двунитевых (Вг) разрывов в сухой ДНК тимуса тел ер ка от дозы рентгеновского облучения в вакууме
Рис. IV. 14. Профиль седиментации ДНК тимуса теленка при облучении сухих ее препаратов в вакууме в дозе 3 • 104' Гр: а) контроль; б) после облучения
Наконец, разрушение азотистых оснований в облученной нуклеиновой кислоте можно обнаружить с помощью специфических химических реакций или по уменьшению оптического поглощения.
Использование перечисленных и ряда других методов позволило установить, что в результате облучения сухих препаратов ДНК возникают следующие типы структурного повреждения макромолекулы:
- одно- и двунитевые разрывы;
- межмолекулярные поперечные сшивки полинуклеотидных цепей;
- разветвленные цепи вследствие суммарного эффекта одно- и двунитевых разрывов (за счет присоединения обломков молекулы, образовавшихся в результате двунитевого разрыва, к местам однонитевых разрывов в цепях ДНК).
