Основы радиационной биофизики - Кудряшов Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Исследования, которые проводятся в последние годы, посвящены идентификации свободнорадикальных состояний, возникающих в облученных белках. Для этого используются ЭПР-сп&ктро-скопия и' другие специальные методы анализа. Установлено, что после облучения сухих ферментов три температуре 77 К на спектрах ЭПР обнаруживается недискретный оинглет. При нагревании образцов до комнатной температуры спектр ЭПР представляет собой уже спектр вторичных радикалов, состоящих из дублета (возможно, а-углеродных радикалов) и сложного спектра радикалов серы (рис. 111-15). Дальнейший анализ должен установить роль наблюдаемых вторичных радикалов в появлении конечных структурных повреждений и в эффекте инактивация фермента. Перспективным для этого может оказаться использование модифицирующих агентов, т. е. воздействий, способных изменить характер возникающих радикальных продуктов. Например, если эти агенты .параллельно изменяют и спектр ЭПР вторичных радикалов, и характер структурных изменений в ферменте, то можно предположить причинную связь между появлением вторичных радикалов и потере» ферментативной активности облученными молекулами.
Рис. III—15. Спектр ЭПР Рис. III—16. Корреляция между по-
рнбонуклеазы, облученной терей ферментативной активности^
при температуре 77 К (по поражением активных центров и кон-
Копелану и др., 1968): А— формационными изменениями химо-
Г — измерение сигнала трипсина, облученного у-лучами
ЭПР при различных темпе- I37Cs (по Толберту, 1966): 1 — оста-
ратурах точная ферментативная активность;
2 — оставшиеся непораженными ак-Для локализации радикалов, тивные центры; 3 — изменение кои-ВОЗНИкаюЩИХ В полипептидной формации, определяемое по оптиче-цепи после облучения, применя- скому вращению fo
ют метод, основанный на использовании тритироваиного сероводорода. Образованные облучением радикалы должны взаимодействовать с 3H2S согласно уравнению
M-+3H2S^3HM + 3HS\
(III-8)
Помещая облученную рибонуклеазу в атмосферу 3H2S и далее подвергая ее гидролизу, устанавливают, в каких аминокислотах содержится радиоактивная метка (3Н), т. е. определяют/локализацию возникших радикалов. Опыты показали, что тритий включался (в убывающем количестве) в лизин, метионин, лролин, гистидин; в небольших концентрациях тритий обнаруживался в фенилаланине, изолейцине и валине. 'В общем, это соответствует количественному 'распределению поврежденных аминокислот в облученной РНКазе.
Радиация
Промежуточные Конечный
продукты эффект
Рис. Ill—17. Свободнораднкальиая модель радиационной инактивации сухих ферментов (по Хенриксену, 1966): I — спектр первичных продуктов; II — процессы, протекающие на физнко-химической стадии; III — образовавшиеся промежуточные продукты; IV, V — конечный эффект — инактивация фермента
При комнатной температуре в облученных молекулах всех еще содержится много нестабильных продуктов. При растворении фермента (.необходимом для определения его активности) нестабильные промежуточные продукты превращаются в стабильные пораженные структуры. Это может быть связано с 'реакцией белковых радикалов или лабильных химических связей с водой либо с увеличением подвижности в растворе отдельных полипеп-тидных цепей. В опытах с рибонуклеазой было показано, что растворение облученной молекулы приводит к ее денатурации. Появление свободных амидных групп и фрагментов лосле раскручивания облученных белков указывает на существование замаскированных разрывов полипептидной цепи. В случае с лизоци-мом при дозе 300 кГр не обнаружено изменения аминокислотного состава (Z?37 инактивации — 266 кГр). Однако выявлены конформационные изменения. Вероятно, они и приводят к инактивации.
В случае с химотрипсином нет единства взглядов на роль отдельных структурных нарушений в эффекте инактивации. Данные
на рис. 111-16 свидетельствуют о /параллелизме между инактивирующим действием излучения, возникновением конформационных изменений в облученной молекуле и потерей способности связывать субстрат активным центром. Эти результаты объясняют по-разному. Первое объяснение состоит в том, что поглощение энергии излучения приводит к нарушению конформации белковой молекулы; это, в свою очередь, вызывает изменение конформации активного центра и его способности связывать субстрат и, как следствие, инактивацию фермента. Другая точка зрения основана на том, что один серинавый и (или) тргаптофановый остаток в особам участке 'химотрипсина, например в активном центре, более радиочувствителен, чем такие же аминокислоты в других участках 'белковой молекулы. При дозе Юы в среднем на одну молекулу фермента разрушается по одному сериновому и трип-тофановому остатку; если эти ключевые аминокислоты регулируют конформацию активного центра, то их 'разрушение приведет к поражению активного центра и, тем самым, к инактивации химотрипсина.
