Основы радиационной биофизики - Кудряшов Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
4. СТРУКТУРНЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ, ВОЗНИКАЮЩИЕ В ОБЛУЧЕННЫХ МАКРОМОЛЕКУЛАХ
Повреждения, возникающие в структуре облученной макромолекулы, могут привести к изменению ее биологических свойств. Поэтому важнейший этап биофизического анализа механизмов инактивации макромолекул ионизирующим излучением состоит в выявлении всех типов структурного повреждения молекул, выяснении природы процессов, приводящих к данному типу повреждения, и в установлении причинно-следственной связи между типом структурного повреждения и характером изменения биологических свойств макромолекулы. Эти вопросы изучены все еще недостаточно.
Анализ структурных повреждений, возникающих в облученной макромолекуле, представляет сложную экспериментальную задачу, требующую использования высокочувствительных методов анализа.
Структурные повреждения, выявляемые в облученных нуклеиновых кислотах. При облучении сухих препаратов ДНК возникает ряд структурных повреждений, которые удается количественно оценить, как правило, при использовании высоких доз излучения, порядка 104 Гр. Это значительно превосходит значение дозы ?)37 для различных типов инактивации. Не исключено, что в действительности инактивация нуклеиновых кислот возникает в результате единичных повреждений, например вследствие разрушения нескольких нуклеотидов. Однако ни одним из современных методов анализа не удается обнаружить столь незначительные повреждения среди десятков тысяч нуклеотидов, составляющих полинуклеотидную последовательность ДНК или РНК.
Для выявления структурных повреждений нуклеиновых кислот испот>зуют различные методы измерения молекулярной массы облученного препарата (седиментационный анализ, изменение све торассеяция, осмоса, характеристической вязкости и т. д.), так как молекулярная масса ДНК или РНК изменяется вследствие двухнитевогЬ разрыва или из-за возникновения сшивок между молекулами. 'Если разрыв произошел только в одной из цепей ДНК, то снижение молекулярной массы выявляется после щелочной денатурации или нагревания до 90°. Количественно число однонитевых разрывов определяют с помощью фермента фосфо-моноэстеразы, который отщепляет неорганический фосфат от всех концевых монофосфоэфирных групп (возможное место разрыва), а количество отщепившегося фосфата измеряют фотометрически. Влияние облучения на число водородных связей в молекуле оценивают по степени ее денатурации, например сопоставив количество кислоты, необходимое для денатурации нативной и облученной ДНК (электрометрическим титрованием). Один из способов определения степени денатурации ДНК основан на использовании гиперхромного эффекта (коэффициент оптического поглощения нативной ДНК примерно на 30% ниже, чем для одиночной цепи или смеси соответствующих нуклеотидов): возрастание ко-
эффициента оптического поглощения облученной ДНК указывает на ее денатурацию. Еще один метод выявления денатурированных участков основан на хроматографическом отделении неповрежденных молекул от молекул, имеющих денатурированные участки. Разрушение азотистых оснований в облученной нуклеиновой кислоте можно обнаружить с помощью специфических химических реакций или по уменьшению оптического поглощения.
Использование перечисленных и ряда других методов позволило установить, что в результате облучения сухих препаратов ДНК возникают следующие типы структурного повреждения макромолекулы:
1 — одно- и двухнитевые разрывы;
2 — межмолекулярные поперечные сшивки полинуклеотид-
ных цепей;
3 — разветвленные цепи вследствие суммарного эффекта оди-
ночных и двойных разрывов (за счет присоединения обломков молекулы, образовавшихся в результате двойного разрыва, к местам одиночных разрывов в цепи ДНК).
Результаты одного из экспериментов по определению одно- и двухнитевых разрывов в ДНК приведены >на рис. III-13.
Одиночные разрывы нити ДНК и разрывы в комплементарных участках обеих нитей пропорциональны поглощенной дозе излучения. Это означает, что двойной разрыв вызывается одиночным событием потери энергии, а не случайным совпадением двух соседних однонитевых разрывав (в противном случае кривая В2 имела бы иной вид). Вероятность двойного разрыва возрастает с увеличением ЛПЭ-излучения). Так, при облучении ус-
коренными ионами аргона ДНК из фага Т7 однонитевые разрывы встречаются только в 2—3 раза чаще двухнитевых» в то время как для ¦уоблучения это отношение достигает 5 или 6.
После облучения сухой ДНК возникают -не только /разрывы полинуклеотидных нитей, но и сшивки между 'ними (пйс. III-14). По сравнению с контрольными образцами максимум^коэффициента седиментации облученной ДНК сдвигается в область меньших значений, т. е. молекулярная масса основной части облу-
ЧеННОГП ППРПЯПЯТЯ ринм/аотла -----—-----------,
вследс
разрывов. Однако наряду с этим наблюдается небольшой пик в области 30—50 5, который не отмечен в контрольном образце. Эта фракция возникла вследствие сшивок между полинуклеотид-ными тяжами ДНК.
Механизм возникновения структурных повреждений ДНК в результате поглощения энергии ионизирующего излучения выяснен недостаточно. Работы в этом .направлении интенсивно проводятся в настоящее время. Большо число исследований посвящено анализу начальной стадии химических изменений в облученных нуклеиновых кислотах, для которой характерно появление -свободных радикалов. Методом ЭПР-спектроскопии .изучают выход и структуру радикалов, возникающих при облучении свободных азотистых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов. Сопоставление этих спектров с -наблюдаемыми при облучении сухой ДНК позволяет ,в ряде случаев идентифицировать радикалы, определяющие спектр облученных нуклеиновых кислот. Один из компонентов сигнала ЭПР облученной ДНК — радикал тимина, -образованный, по мнению ряда авторов, продуктом присоединения атомарного водорода к Сб-атомам тимина. Аналогичной эффект можно продемонстрировать при действии на порошкообразный образец атомарным водородом, полученным при газовом разряде:
