Фотобиология - Конев С.В.
Скачать (прямая ссылка):
парциальное поглощение цистина сравнимо с поглощением ароматических
аминокислотных остатков. По данным Сетлоу, при облучении различных белков
светом с длиной волны 250 нм соблюдается прямая пропорциональность между
содержанием в них цистина и величиной квантового выхода фотоинактивации.
Тем не менее даже в белках, богатых цистином, при длинноволновом
облучении (270-310 нм) преобладает "триптофановая" фотоинактивация,
только при коротковолновом (240-260 нм) - щистиновая". В соответствии с
этим белки, инактивированные коротко-и длинноволновым УФ-облучением, судя
по данным се-диментационного анализа, различаются конечным кон-
формационным состоянием.
Вторым основным методом идентификации акцепторов биологически активного
света является хроматографический анализ гидролизатов облученных белков,
который позволяет определить, какие и сколько аминокислотных остатков
разрушилось под действием света. Хроматографический анализ
аминокислотного состава облученных (К=254 нм) химотрипсина и трипсина
показал, что на одну инактивированную молекулу первого белка приходится
один разрушенный остаток триптофана, а в случае трипсина - один остаток
триптофана и два-три остатка цистина.
Если за фотоинактивацию действительно ответственны только кванты света,
поглощаемые триптофаном и цистином, то поперечное сечение инактивации
белка (Об) должно быть равно сумме поперечных сечений фо-
3. Роль хромофоров в фотоинактивации белков 251
толиза триптофана (оТр) и цистина (ац) с учетом их числа (ттртц) в
макромолекуле. При этом аТр и ац определяются экспериментально на
основании данных по фотолизу аминокислот в растворе или в белке:
Об" ^НтрОтр-}-ШцОц.
Мак Дареном и Лузом для некоторых (но не всех) белков было получено
удовлетворительное совпадение расчетных и экспериментально определенных
значений квантовых выходов (ср) фотоинактивации из соотношения ф-a/s, где
s - поперечное сечение поглощения. Уязвимым местом в подобном подходе
является произвольное предположение об одинаковой значимости фотолиза
любой аминокислоты для инактивации макромолекулы и совпадении поперечных
сечений поглощения и фотолиза аминокислот в свободном состоянии и в
составе белка.
Значительно более корректны работы Ю. А. Владимирова с сотр., в которых
определялись поперечные сечения инактивации белка и фотолиза входящих в
его состав аминокислот не при одной, а при двух длинах волн: 254 и 280
нм. Это позволило им получить ответ на вопрос, приводит ли к инактивации
деструкция любого, "первого попавшегося" остатка триптофана (или
цистина), либо только определенного "ключевого" аминокислотного остатка.
Составив систему уравнений
Of4 =Щтр0254 +тц0254.
Од80 = /Игр с"° + /ЯцО*80,
авторы определили поперечные сечения фотолиза триптофана (оТр) и цистина
(оц), а также количество тех остатков, разрушение которых сопровождается
инактивацией. Таким способом было установлено, что у пепсина, содержащего
четыре остатка триптофана и три остатка цистина, к инактивации приводит
разрушение только одного из них. Деструкция остальных трех остатков
триптофана и всех трех остатков цистина не приводит к инактивации
фермента. Сходная картина наблюдалась и у трипсина. Из четырех остатков
триптофана и шести остатков цистина критическое значение имели лишь один
остаток триптофана и один остаток цистина. Из этих данных следует, что к
инактивации приводит разрушение
252 Глава XIII. Действие УФ-света на белки
не всякого, а только строго определенного триптофаново-го или цистинового
остатка. Таким образом, именно триптофан и цистин имеют первостепенное
значение для фотоинактиващш белков.
Иные возможные элементарные фотохимические повреждения в белке - разрывы
полипептидной цепи, фото-
гетероциклических и ароматических аминокислот - не вносят решающего
вклада в инактивацию. Так, гипотеза об инактивации белков через разрыв
пептидных связей оказалась несостоятельной по следующим причинам: 1)
согласно Мак Ларе-ну, квантовый выход фотолиза пептидной связи не
превышает 0,0003, что, по крайней мере, на порядок ниже квантового выхода
инактивации белков; 2) при облучении химотрипсина и лизоцима даже такими
дозами УФ-света, которые приводят к почти полной инактивации, заметного
увеличения количества свободных аминогрупп не наблюдается. И только
длительное облучение уже денатурирован-белков сопровождается их
фрагментацией в результате прямых разрывов полипептидной цепи.
По аналогичным причинам несущественна роль реакций фотохимического
дезаминирования и декарбоксили-рования аминокислот в белке, хотя
протекание этих реакций четко регистрируется при облучении свободных
аминокислот в растворе. Иными словами, фотохимия алифатических
аминокислот и разрывы пептидной связи происходят только иа "трупе"
белковой макромолекулы.
Следует подчеркнуть также, что хроматографический анализ белков,
облученных умеренными дозами УФ-све-
лиз других алифатических,
180 220 260 300 А,нм
Рис. 49. Спектры поглощения (1, 2) и спектры действия инактивации (О, А)
