Фотобиология - Конев С.В.
Скачать (прямая ссылка):
поглощения тимидина, что также под-
I I
тверждает предположение о димерной (Т - Т) природе поперечных сшивок.
Кроме того, показано, что квантовый выход образования сшивок тем выше,
чем больше в ДНК содержится аденина и тимина. Как и димеры тимина, сшивки
фотореактивируются.
Остается, однако, неясной природа межмолекулярных сшивок, возникающих при
УФ-облучении сухих препаратов ДНК и головок сперматозоидов лосося, в
которых молекулы ДНК, как известно, плотно упакованы. Выявить такие
сшивки при облучении растворов ДНК не удалось. Следовательно,
межмолекулярные ДНК - ДНК сшивки эффективно образуются при облучении
подсушенных, но не влажных клеток, вирусов и ДНК. Они уменьшают
растворимость ДНК и способствуют ее геле-образованию. Известно, что
квантовый выход образования межмолекулярных сшивок составляет 10-2. По
мнению Шугара, за образование сшивок ДНК-ДНК ответственны также тиминовые
димеры, но, видимо, не цик-лобутанового типа.
14. СШИВКИ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА - БЕЛОК
Первым косвенным свидетельством фотохимического образования ковалентных
сшивок между ДНК и белком было обнаруженное Смитом ухудшение
экстрагируемое(tm) ДНК из Е. coli, подвергнутой УФ-облучению. После
обработки лизированных клеток трипсином экстрагируемое(tm) ДНК полностью
восстанавливалась. В последующих работах Смита образование подобного рода
сшивок было воспроизведено in vitro в смеси ДНК - бычий сывороточный
альбумин.
240 Глава XII. Действие УФ-света на нуклеиновые кислоты
Акцептором активного света являются оба компонента, поскольку
предварительное облучение как белка, так и ДНК перед смешиванием
сопровождается возникновением сшивок. На основании этого
непосредственными предшественниками сшивок считают не синглет-ные или
триплетные возбужденные состояния хромофоров, а некие долгоживущие
продукты, возможно, свободнорадикальной природы. Смит обнаружил, что при
облучении полирибоуридиловой, полирибоцитиди-ловой,
полидезоксицитидиловой, полидезокситимидило-вой кислот, РНК и ДНК с
цистеином происходит его химическое комплексирование с этими
полинуклеотидами, и определил константы скоростей соответствующих
реакций. Константа скорости взаимодействия цистеина с ДНК равна сумме
констант скоростей его взаимодействия с отдельными нуклеотидами.
В связи с этим можно полагать, что в реальных условиях сшивки нуклеиновой
кислоты с белком происходят с участием прежде всего цистеина. В 1966 г.
Смитом выделен и идентифицирован стабильный продукт взаимодействия
урацила и цистина - 5-цистеин-6-гидроурацил.
Однако позднее благодаря работам Джонса и Шетла-ра стало очевидным, что в
модельных условиях кроме цистеина ковалентно присоединяться к урацилу при
УФ-облучении могут еще десять аминокислот. В свою очередь высокую
реакционную способность при образовании сшивок с аминокислотами проявляет
и тимин. Джонс детально изучил образование смешанных фотопродуктов из
тимина и цистеина. По его данным, УФ-свет индуцирует образование, по
крайней мере, пяти различных фотопродуктов, которые хорошо разделяются и
идентифицируются с помощью хроматографии.
NH,
И
15. Денатурация нуклеиновых кислот
241
Итак, в комплексе ДНК - аминокислота ковалентная связь образуется с
участием отдельных оснований и прежде всего тимина и урацила. Смит
полагает, что аминокислоты белков через SH- и ОН-группы присоединяются к
пятому (или шестому) углеродному атому основания.
15. ДЕНАТУРАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Фотоденатурация нуклеиновых кислот является следствием разрушения
кооперативной системы слабых нековалентных связей (водородные,
гидрофобные и т. д.) и частичного (локального) или полного нарушения
двуспиральной структуры Уотсона - Крика (эффект "расплетания"). Наиболее
вероятно, что денатурация нуклеиновых кислот представляет собой вторичный
темновой процесс, вызванный образованием фотопродуктов, хотя не исключена
возможность прямого разрыва слабых связей при тепловой диссипации энергии
электронного возбуждения оснований, как это предполагается для белков.
Несмотря на то, что спектр действия денатурации ДНК совпадает со спектром
поглощения тимидина, причастность тиминовых димеров к образованию
денатурированных участков в ДНК остается до сих пор сомнительной. Г. Б.
Завильгельским твердо установлено, что локальные нарушения вторичной
структуры ДНК при ее облучении коротковолновым светом определяются
индукцией сшивок между комплементарными нитями ДНК. Наиболее точно такой
вывод подтверждается опытами, в которых миграционным путем с ацетофенона
на тимин изменялось количество тиминовых димеров в ДНК. При этом каких-
либо различий в кривых плавления, отражающих состояние вторичной
структуры, у образцов ДНК, содержащих 0,17 и 30% димеров, обнаружить не
удалось. В то же время кинетика образования сшивок и локальных
денатурационных участков в ДНК идентична.
Эффект денатурации можно выявить с помощью спектрофотометрических,
вискозиметрических, седиментаци-онных измерений, методами дисперсии
