Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Если на стенке отгонной колбы остаются капли воды, их удаляют добавлением 0,2—0,3 мл ацетона с последующей его отгонкой.
135
После этого колбы с липидами тщательно протирают полотенцем и в открытом состоянии помещают в эксикатор, заполненный вла-гопоглощающим веществом. Через 2—3 ч взвешивают на аналитических весах. Определяют количество липидов, добавляют в колбу определенное количество хлороформ-метаноловой смеси (для получения раствора нужной концентрации), тщательно растворяют липиды и переносят их в пробирку с притертой пробкой, продувают азотом, закрывают и хранят в холодильнике.
2. Экстракт липидов доводят до определенного объема. 1—2 мл раствора переносят в предварительно взвешенный бюкс или небольшой стакан и помещают на песчаную баню под вытяжным шкафом или в термостат при 60 0C Высушивают до постоянной массы. На основании количества липидов, обнаруженных в высушенном объеме экстракта, определяют концентрацию липидов в исследуемом субстрате.
Исходный или концентрированный экстракт после определения в нем концентрации липидов используют для определения содержания фосфолипидов, триацилглицеринов, холестерина или изучения жирнокислотного состава общих липидов.
Метод экстракции липидов спиртово-эфирной смесью (по Блюру). Принцип. Метод аналогичен предыдущему, но для экстракции применяют смесь других полярных (этиловый спирт) и неполярных (диэтиловый эфир) растворителей. В результате данный метод не обеспечивает полной экстракции фосфолипидов, ганглиозидов и протеолипидов.
Реактивы: смесь этилового эфира и диэтилового эфира (3 : 1); петролейный эфир.
Оборудование: пипетки на 1, 5 и 10 мл; колбочки с притертой пробкой на 50 и 100 мл; воронки; пробирки с притертой пробкой; бумажные фильтры; роторный испаритель; водяная баня; аналитические весы.
Ход определения. В плоскодонную колбу вносят необходимый объем сыворотки крови (1—3 мл или больше) или несколько граммов гомогената тканей, заливают 20 объемов спиртово-эфирной смеси, перемешивают и оставляют на 12 ч при комнатной температуре. Экстракцию можно ускорить кратковременным подогревом (2—3 мин) при температуре 40 °С. Липидный экстракт отфильтровывают от выпавшего белка и концентрируют выпариванием на роторном испарителе. Затем липиды экстрагируют тремя порциями петролейного эфира, отбрасывая нерастворимый осадок. Концентрацию липидов в экстракте определяют взвешиванием одним из изложенных выше методов.
Экстракт используют для определения главным образом холестерина и триацилглицеринов, поскольку фосфолипиды экстрагируются не полностью.
Клиническое значение. Физиологическая гипер-липеми? отмечается через 1—3 ч после скармливания животным
136
кормов, обогащенных липидами, а также у кур, индеек, уток, гусей и других птиц (самок) в период их полового созревания, подготовки к яйцекладке и в период интенсивной продуктивности. Патологическая гиперлипемия наблюдается у коров с патологией обмена веществ и алиментарным бесплодием, при концентратном типе кормления, ожирении, остром и хроническом гепатите, хроническом нефрите, гипофункции щитовидной железы, передней доли гипофиза, недостаточной активности сывороточной липопротеи-новой липазы (ЛПЛ), расщепляющей триацилглицерины сыворотки крови (фактор просветления).
Концентрация общих липидов в сыворотке крови в норме составляет у крупного рогатого скота 280—600 мг/100 мл, у свиней — 350-400, кур 360-2100 мг/100 мл.
Источник: 57.
Определение общих липидов в сыворотке крови с сульфофосфова-нилиновым реактивом (по Цёлнеру—Киршу в изложении Л. В. Орлова). Принцип. Метод основан на цветной реакции продуктов распада ненасыщенных липидов в серной кислоте с реактивом, состоящим из ванилина и ортофосфорной кислоты. Механизм цветной реакции заключается в том, что ненасыщенные липиды реагируют с серной кислотой при нагревании с образованием карбо-ниевого иона, взаимодействие которого с активированной карбоксильной группой ванилина фосфата образует стабильный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.
Реактивы: серная кислота (H3SO4) концентрированная (х. ч.) или для пробы Соваля;
ортофосфорная кислота (Н3РО4) концентрированная;
ванилин (х. ч.), 0,6%-ный раствор. 0,6 г ванилина растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды с нагреванием на водяной бане, после охлаждения доводят объем до 100 мл. Раствор стабилен при хранении при комнатной температуре;
фосфор-ванилиновый реактив. 4 части ортофофорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6%-ного раствора ванилина. Хранят в темной склянке при комнатной температуре;
хлороформ (х. ч. или для наркоза);
стандартный раствор в хлороформе триолеина или холестерина (х. ч.) со свежим топленым и профильтрованным сливочным маслом в соотношении 1: 3 или общие липиды, выделенные из сыворотки крови или печени. Взвешивают на аналитических весах 1200 мг триолеина или других указанных липидов и растворяют в мерной колбе на 100 мл. Хранят в темной склянке с притертой пробкой в холодильнике.