Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Образование 2,4-динитрофенилгидрозона пировиноградной кислоты. В пробирку с притертой пробкой вносят 1 мл безбелкового
122
фильтрата крови и помещают в водяную баню при температуре 25 °С на 10 мин. Добавляют 0,25 мл 0,1 %-ного раствора 2,4-динит-рофенилгидрозина. Пробу выдерживают 10 мин при комнатной температуре (для образования гидрозина пировиноградной кислоты).
Экстракция 2,4-динитрофенилгидрозона пировиноградной кислоты. К реакционной смеси добавляют 2 мл толуола, пробирку закрывают пробкой и содержимое ее тщательно встряхивают в течение 3 мин. Пробу на 10 мин оставляют для расслоения жидкости. После этого осторожно с помощью шприца и пипетки удаляют нижний водяной слой. К толуоловому экстракту добавляют 1,5 мл 10%-ного раствора натрия карбоната и хорошо взбалтывают, снова дают разделиться слоям жидкости. На этом этапе гидрозон пировиноградной кислоты переходит в содовый раствор.
Колориметрирование. Из нижнего содового раствора отбирают 1,25 мл, вносят в чистую пробирку, прибавляют 1,25 мл 1,5 моль/л раствора натрия гидроксида. При этом развивается красно-бурая окраска, специфичная для 2,4-динитрофенилгидрозона пировиноградной кислоты. Через 20 мин проводят фотометрирование в кювете с толщиной слоя 5 мм при длине волны 465 нм (синий светофильтр) против контроля.
Контроль готовят так же, как опытную пробу, только без крови. В качестве контроля может быть использован 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
Параллельно проводят обработку калибровочного раствора пировиноградной кислоты или натрия пировинограднокислого, содержащего 1 мг% пировиноградной кислоты, так же, как и пробу крови.
Расчет ведут по формуле
где X — количество пировиноградной кислоты на 100 мл крови, мг; А — экстинкция опытной пробы; В — экстинкция калибровочной пробы; 1 — содержание пировиноградной кислоты в стандартной пробе, мг%.
При переводе мг% в мкмоль/л полученную величину умножают на 113,6.
Расчет можно проводить по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору пировиноградной кислоты или натрия (лития) пировинограднокислого и содового раствора. Готовят стандартный раствор, содержащий в 1 мл 50 мкг пировиноградной кислоты. Далее берут 7 пробирок и вносят последовательно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,6, 0,8 и 1 мл стандартного раствора. В каждую пробирку добавляют соответственно 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,4 и 0,2 мл дистиллированной воды. Затем добавляют последовательно в том же порядке все реактивы, как и в опытную пробу, проводят колориметрирование и строят калибровочную кривую. Откладывают на оси ординат величину оптической плотности, а на оси абсцисс —
123
соответствующее ей количество пировиноградной кислоты в мкг в 1 мл (т. е. 5, 10, 15, 20, 30, 40 и 50 мкг/мл).
Клиническое значение. Пировиноградная кислота — промежуточный продукт углеводного и белкового обменов. Она тесно связана с обменом тиамина. Тиамин в форме тиаминдифосфата является коферментом декарбоксилаз, участвующих в окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты. При недостатке тиамина в крови и моче повышается концентрация пировиноградной кислоты со всеми последующими патологическими явлениями. Нормальное содержание пировиноградной кислоты в крови колеблется от 0,6 до 1,7 мг%, или от 68 до 193 мкмоль/л (см. приложение 5). Ее содержание в крови повышается при гиповитаминозе Bi, нарушении окислительно-восстановительных процессов в условиях дефицита кислорода, болезнях печени, кетозе и т. д.
Источник: 48.
Определение молочной кислоты по реакции с параоксидифени-лом. Принцип. Из молочной кислоты в присутствии серной, фосфорной кислот и солей меди образуется уксусный альдегид, который, реагируя с параоксидифенилом (CgHsCgH4OH), дает фи-олетово-окрашенные продукты. Реакция очень чувствительная, поэтому нужно строго выдерживать все условия выполнения исследования. В пробирку для взятия крови добавляют смесь ЭДТА и натрия фторида. Кровь немедленно охлаждают. Анализ проводят быстро.
Реактивы: концентрированная серная кислота, выдерживающая пробу Саваля (х. ч., плотность 1,84), от ее качества зависит возможность выполнения анализа, иногда качество кислоты можно улучшить, нагревая ее и по каплям добавляя в нагретую кислоту пероксид водорода;
смесь из 3 г меди сульфата (CaSO4 • 5H2O, ч. д. а., х. ч.) и 9 мл орфтофосфорной кислоты (H3PO4, ч. д. а., х. ч.), через некоторое время должен образоваться гомогенный раствор;
1,5 %-ный раствор параоксидифенила (CgHsCgH4OH) в диме-тилформамиде. Растворяют 15 мг параоксидифенила в 1 мл диме-тилформамиде;
5 %-ная трихлоруксусная кислота (0,3 н.).
Ход определения. 0,02 мл крови вносят в 1 мл 5 %-ной трихлоруксусной кислоты.Через несколько минут центрифугируют 15 мин при 3000 мин ^ К 0,2 мл центрифугата прибавляют 0,1 мл смеси медного купороса и ортофосфорной (фосфорной) кислоты и 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Энергично встряхивают и точно через 3 мин ставят ровно на 3 мин в кипящую водяную баню, затем еще 3 мин охлаждают в ледяной воде. Добавляют 1 каплю раствора параоксидифенила в диметилформамиде, капля должна сразу попасть в центр пробирки. Встряхивают и оставляют стоять 10 мин при комнатной температуре. После этого нагревают на кипящей водяной бане 1,5 мин, охлаждают в воде и фотометрируют при длине волны 565 нм.
