Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Холостая проба. 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 ммоль/л раствора натрия гидроксида доводят до объема 10 мл водой.
107
Калибровочную пробу обрабатывают точно так же, как и опытную, но вместо сыворотки крови берут 2 мл рабочего 0,1 ммоль/л (1 мг%) раствора креатинина; пробу при этом не центрифугируют. Можно строить калибровочный график. Из рабочего калибровочного раствора креатинина готовят разведения, как указано в таблице 15.
15. Разведения рабочего калибровочного раствора креатинина
№
пробирки
Рабочий калибровочный раствор, мл
Раствор пикриновой кислоты, мл
2,5 моль/л раствор натрия гидроксида, мл
Дистиллированная вода, мл
Концентрация креатинина в пробе, мкмоль/л
1
0,4
3,0
0,2
До объема
40
10 мл
2
0,8
3,0
0,2
То же
80
3
1,6
3,0
0,2
»
160
4
2,4
3,0
0,2
»
240
5
3,2
3,0
0,2
320
Через 10 мин проводят измерения при тех же условиях, что и опытные пробы. Калибровочная кривая линейна до 260 мкмоль/л креатинина.
Расчет концентрации креатинина в сыворотке ведут по формуле
X= -0,1 или -1,
где X — содержание креатинина в сыворотке, ммоль/л или мг%; E0n — экстинкция опытной пробы; Ек — экстинкция калибровочной пробы; 0,1 концентрация креатинина в калибровочной пробе, ммоль/л; 1 — концентрация креатинина в калибровочной пробе, мг%.
При переводе в мг% полученную величину умножают на 10. Источник: 43.
Клиническое значение. В организме животных кре-атинин образуется из креатина, источники которого аминокислоты аргинин, глицин, метионин. Креатин при фосфорилировании превращается в креатинфосфат, а затем в креатинин. Креатин и креатинфосфат участвуют в процессах, связанных с мышечными сокращениями.
В сыворотке крови содержится в основном креатинин, поэтому его и определяют. Количество его у животных различных видов колеблется от 40 до 160 мкмоль/л (0,45—1,9 мг%), у кур — 120-350 мкмоль/л (1,4-4,0 мг%).
Повышение концентрации креатинина в крови наблюдается при почечной недостаточности, прогрессирующих диффузных заболеваниях почек, закупорке мочевых путей, подагре, кишечной не-
108
проходимости, механической желтухе, голодании, мышечной дистрофии.
Понижение количества креатинина не имеет клинического значения.
Определение билирубина в сыворотке крови по диазореакции (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа). Принцип. Под действием HCl разрывается тетрапирроловая связь билирубина и образуется два дипиррола, которые диазотируются диазобензосульфа-новой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилируби-на. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный — после добавления кофеинового реактива.
Реактивы: кофеиновый реактив. 5 г чистого кофеина, 7,5 г натрия бензоата, 12,5 г натрия ацетата растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают до 50—60 "С, хорошо перемешивают. После охлаждения доводят дистиллированной водой до 100 мл. Срок хранения 2 нед;
натрия хлорид (ч. д. а. или х. ч.), 154 моль/л. 0,9 г натрия хлорида помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят водой до метки.
HCl концентрированная (ч. д. а., х. ч.);
сульфаниловая кислота (ч. д. а.);
диазореактив I. 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300—400 мл дистиллированной воды, прибавляют 15 мл концентрированной HCl (плотность 1,19 кг/м3). Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после полного растворения сульфаниловой кислоты и охлаждения раствор доливают дистиллированной водой до 1 л. Реактив стойкий, хранят в посуде из темного стекла;
диазореактив II. Натрия нитрит (NaNO2, ч. д. а., х. ч.), 5 г/л (0,07 моль/л). 0,5 г натрия нитрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Реактив стабилен в течение 2 нед при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II;
билирубин для построения калибровочного графика, 800 мг/л, или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать наборы отечественных или зарубежных фирм, содержащие билирубин высокой степени чистоты. Растворы билирубина нестойкие, поэтому их готовят с добавлением белка в качестве стабилизатора;
натрия карбонат, 0,1 моль/л. 10,6 г безводного Na2CO3 растворяют и доводят до 1 л дистиллированной водой;
уксусная кислота, 4 моль/л. 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; колбы мерные.
109
Ход определения. ВЗ пробирки (для общего и связанного билирубина и для контроля) вносят реактивы, как указано в таблице 16.
16. Смеси реактивов для определения билирубина в сыворотке крови
Ингредиент
Опытная проба, мл
Холостая проба, мл
Общий билирубин
Связанный билирубин
Сыворотка крови (негемолизирован-
0,5
0,5
0,5
ная)
Кофеиновый реактив
1,75
