Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
75
гормона, кальцитонина и других веществ, непосредственно связанных с минеральным обменом.
Определение общего кальция в сыворотке крови комплексоно-метрическим методом с индикатором флуорексоном (по Вичеву, Кара каш еву). Принцип. Использование флуорексона для комп-лексонометрического определения кальция основано на том, что его водные растворы в сильно щелочной среде не флуоресцируют, но в этих же условиях флуорексон образует с кальцием флуоресцирующие комплексы.
Комплекс индикатора с металлом менее прочен, чем комплекс металла с трилоном Б, поэтому по мере добавления трилона Б к раствору, содержащему металл и индикатор, ионы металла постоянно переходят к трилону Б. При титровании трилоном Б в точке эквивалентности отмечается резкое «затухание» флуоресценции.
Реактивы: 0,1 н. раствор трилона Б (ЭДТА). Готовят из стандарт-титра;
0,005 н. раствор трилона Б. Готовят из 0,1 н. раствора трилона Б: 10 мл 0,1 н. раствора трилона Б в мерной колбе доводят дистиллированной водой до 200 мл. Устойчив 2 мес;
индикаторная смесь: индикатор флуорексон (ч. д. а.) и калий хлорид (ч. д. а., х. ч.) в соотношении 1 : 100;
1 н. раствор калия гидроксида (ч. д. а., х. ч.). Допускается примесь кальция не более 1 мг%;
стандартный 100 мг%-ный раствор кальция: 2,497 г кальция карбоната (х. ч.), высушенного до постоянной массы при 100—120 °С, вносят в мерную колбу на 1 л, добавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты и после растворения соли доводят объем бидистил-лированной водой до метки. 1 мл раствора содержит 1 мг кальция;
рабочий 10 мг%-ный раствор кальция. Готовят разведением 100 мг%-ного раствора кальция дистиллированной водой 1 : 10 (1 мл 100 мг%-ного раствора кальция и 9 мл воды). Рабочий раствор кальция необходим для установления «затухания» флуоресценции при титровании и контрольной проверке метода.
Оборудование: микробюретка емкостью на 2 мл с градуировкой на 0,01 мл, оканчивающаяся вытянутым капилляром с оттянутым концом, что дает возможность проводить титрование меньшими каплями; пипетки емкостью на 1 и 10 мл; стаканчики для титрации (лучше полистироловые).
Посуду перед использованием выдерживают в разведенных растворах трилона Б и многократно промывают бидистиллированной водой.
Ход определения. В стаканчик вносят 20 мл дистиллированной воды, 5 мл раствора калия гидроксида и несколько кристалликов индикаторной смеси. Появляется флуоресценция, обусловленная присутствием в приготовленной смеси кальция.
Для связывания кальция в смесь из микробюретки добавляют по каплям раствор трилона Б до исчезновения флуоресценции и появления бледно-розового окрашивания. Обычно для этого тре-
76
буется одна капля раствора трилона Б. Большее количество свидетельствует о высокой концентрации кальция в растворе калия гидроксида и его непригодности для анализа. Примесь кальция в растворе может быть обусловлена некачественной подготовкой посуды или неисправностью дистиллятора.
После связывания кальция, находящегося в растворе натрия гидроксида, в этот же стаканчик добавляют 0,5 мл сыворотки крови и снова оттитровывают раствором трилона Б до исчезновения флуоресценции и появления бледно-розового окрашивания.
Расчет ведут по формуле Ca = а • 20, где а — количество раствора трилона Б, пошедшее на титрование сыворотки крови, мг%; 20 — коэффициент для пересчета в мл при условии, что титр 0,005 н. раствора трилона Б равен 1. Для перевода мг% в ммоль/л полученную величину делят на 4 или в качестве коэффициента берут не 20, а 5. Примечания. Используют сыворотку, свободную от гемолиза, ли-пемии, не желтушную. Венозную кровь отстаивают при комнатной температуре в течение 30—60 мин до полного образования сгустка или помещают в термостат при 37 °С на 30—60 мин. В закрытой пробирке сыворотку можно хранить 7 дней при температуре 4—5 °С. Ложнозавышенные результаты вызывают билирубин и ионы меди в методах титрования с ЭДТА, корковые пробки, гемоглобин, липемия, оксалаты. Определение общего кальция в сыворотке крови комплексоном Арсеназо III. Принцип. Арсеназо III — металлокомплексон из группы диазокомплексообразователей, которые имеют неодинаковое сродство к различным ионам металлов. Наибольшее сродство проявляется к ионам Th, UO22-, Zr, Pu, меньшее — к ионам Ba, Ca, Sr. Из этих ионов в сыворотке крови в значительном количестве присутствует только ион Ca. При смешивании раствора Арсеназо III и сыворотки крови образуется комплекс кальция с Арсеназо III, который характеризуется поглощением излучения с максимумом 650—670 нм. Интенсивность поглощения прямо пропорциональна концентрации кальция в диапазоне 0,5—3,5 ммоль/л. Реактивы: Арсеназо III (ч. д. а.);
натрия додецилсульфат (ч.); ледяная уксусная кислота (х. ч.);
натрия ацетат (ч. д. а.);
кальция карбонат безводный (ч. д. а.);
соляная кислота (ч. д. а.).
Рабочие растворы реактивов: 0,1 моль/л ацетатный буфер с pH 4,75. Для приготовления 1 л буфера смешивают 454 мл 0,1 моль/л уксусной кислоты и 500 мл 0,1 моль/л натрия ацетата трехводного. Для приготовления 0,1 моль/л уксусной кислоты 2,86 мл кислоты (d = 1,05 г/см , 17,5 н.) вносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления 0,1 моль/л раствора натрия ацетата трехводного
