Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
У сук в течение стадии возбуждения полового цикла (длительность 7—11 дней) уровень прогестерона составляет 0,4 + 0,1 нг/мл, в начале течки — 1,1 ± 0,1, т. е. в этот период прогестагенная активность яичников находится на низком уровне. В конце эстраль-
459
ного периода желтые тела становятся функционально активными и поэтому содержание прогестерона увеличивается до 5,3 ± 0,3 нг/мл. После окончания периода половой охоты наступает стадия торможения полового цикла (длительность ее 50—60 дней). В начале этой стадии концентрация прогестерона составляет 17,4 ± 0,6 нг/мл, в середине щенности (на 30-й день) — 26,8 ± 0,7 нг/мл, на 55-е сутки щенности — 4,3 + 0,3 нг/мл. После стадии торможения наступает период полового покоя длительностью 115—130 сут. Уровень прогестерона в начале и в конце этого периода стабилен — 0,9 ± 0,1 нг/мл (П. В. Ковалев, 2002).
9.10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭСТРАДИОЛА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INCCIiJA)
Принцип. Метод основан на конкурентном связывании эст-радиола исследуемой сыворотки и конъюгата эстрадиола-ПХ (пе-роксидазы хрена) с постоянным количеством кроличьего антиэст-радиола. В ячейки, покрытые антикроличьими IgG, добавляют стандарты, контроли и исследуемые пробы сыворотки, конъюгат эстрадиола-ПХ и кроличий антиэстрадиоловый реагент. Во время инкубации при комнатной температуре (18—25 °С) известное количество меченного пероксидазой хрена эстрадиола конъюгирует с эндогенным эстрадиолом в стандарте, пробе и контроле за определенное число мест связывания на специфических антителах к эст-радиолу. При этом количество связанного меченного пероксидазой эстрадиола обратно пропорционально содержанию эндогенного эстрадиола в исследуемой сыворотке.
Несвязанный конъюгат меченого эстрадиола отмывают из ячеек, добавляют хромогенний раствор и после развития голубой окраски добавляют стоп-раствор для остановки цветной реакции. Считывание результатов проводят на ридере при длине волны 450 нм.
Реактивы: 96 микротитрационных ячеек, покрытых козьими антикроличьими IgG;
референс-стандарты эстрадиола, готовые к использованию — 6 флаконов по 0,5 мл с концентрациями 0,0, 10,0, 30,0, 100,0, 300,0 и 1000,0 пг/мл;
кроличий антиэстрадиоловый реагент (розового цвета) — 1 флакон (7 мл);
конъюгат эстрадиола и ПХ (голубого цвета) — 1 флакон (12 мл); эстрадиоловые контроли — 2 флакона по 0,5 мл с уровнями I и II. Готовые к использованию;
ТМБ-реагент — 1 флакон (11 мл);
стоп-раствор (кислота хлористоводородная) — 1 флакон (11 мл); деионизированная или бидистиллированная вода. Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и
460
тщательно перемешать. Материал для анализа — сыворотка или плазма крови без гемолиза и липи-демии. Пробирку с кровью помещают в воду со льдом. Следует как можно быстрее отценгрифуги-ровать сыворотку или плазму, охладить до 4—8 °С или заморозить. Эстрадиол стабилен в сыворотке или плазме при 4—8 °С 1 день, при минус 20 °С — длительное время. Оборудование: микроплашечный иммуноферментный анализатор (ридер); автоматическое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки на 25, 50, 100, 200 мкл и 1,0 мл; фильтровальная бумага или бумажные салфетки для просушивания стрипов; миллиметровая бумага.
Подготовка реагентов к анализу. Перед использованием все реагенты и пробы необходимо привести к комнатной температуре (18—25 °С). Сыворотки, в которых ожидается концентрация эстра-диола свыше 1000 пг/мл, следует предварительно развести разбавителем сыворотки.
Ход определения. Закрепляют в штативе необходимое количество ячеек. Вносят по 25 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб (в параллелях) в соответствующие ячейки. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл конъюгата эстрадиола-ПХ и по 50 мкл кроличьего анти-эстрадиолового реагента. Тщательно и аккуратно перемешивают в течение 30 с. Инкубируют при комнатной температуре (18—25 °С) на протяжении 90 мин. При помощи автоматического промывающего устройства исследуемые ячейки пятикратно промывают бидистиллированной водой. Остатки жидкости в ячейках удаляют, переворачивая и постукивая плашкой по фильтровальной бумаге. Вносят в каждую ячейку по 100 мкл ТМБ-хро-могенного раствора, осторожно перемешивают в течение 5 с. Инкубируют при комнатной температуре (18—25 °С) 20 мин. Добавляют по 100 мкл стоп-раствора (кислоты хлористоводородной) в каждую ячейку. Осторожно перемешивают 30 с. Очень важно, чтобы голубая окраска полностью перешла в желтую. Считывают абсорбцию на ридере при длине волны 450 нм в течение 15 мин.
По полученным результатам стандартов строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию гормона в исследуемых пробах сыворотки. При подсчете результаты предварительно разведенных образцов умножают на фактор разведения.
Клиническое значение. Эстрадиол — естественный эстроген, секретируемый преимущественно яичниками и в незначительных количествах корой надпочечников, у беременных плацентой, у самцов семенниками. Эстрадиол обеспечивает развитие, диф-ференцировку и функциональную активность органов размножения самок, стимулирует рост и развитие фолликулов, повышает чувствительность яичников к действию гонадотропинов. Он ускоряет рассасывание желтых тел и наступление очередного полового цик-
