Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Несвязанный конъюгат меченого прогестерона отмывают из ячеек, добавляют хромогенный раствор и после развития окраски добавляют стоп-раствор для остановки цветной реакции. Считывание результатов проводят на ридере при длине волны 450 нм.
Реактивы: 96 микротитрационных ячеек, покрытых козьим антикроличьим IgG;
457
референс-стандарты прогестерона — 6 флаконов по 0,5 мл с концентрациями 0,0, 0,5, 3,0, 10,0, 25,0 и 50,0 нг/мл. Готовы к использованию;
кроличий антипрогестероновый реагент (розового цвета) — 1 флакон (7 мл);
конъюгат прогестерона и ПХ (голубого цвета) — 1 флакон (12 мл); прогестероновые контроли — 2 флакона по 0,5 мл с уровнями I и П. Готовы к использованию;
ТМБ-реагент — 1 флакон (11 мл); стоп-раствор — 1 флакон (11 мл); деионизированная или бидистиллированная вода. Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешать. Сыворотка или плазма крови, свободная от гемолиза. Антикоагулянт — ЭДТА. Кровь из вены берут в пластиковую пробирку, которую помещают в воду со льдом, центрифугируют, сливают во вторичную пробирку, охлаждают (4 °С) или замораживают. Прогестерон стабилен в сыворотке и плазме в герметично закрытой пробирке в течение 1 дня при 4—8 °С, при минус 20 °С — длительное время. Оборудование: микроплашечный иммуноферментный анализатор (ридер); инкубатор-шейкер для микропланшет; автоматическое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки на 25, 50, 100, 200 мкл и 1,0 мл; фильтровальная бумага или бумажные салфетки для просушивания стрипов; миллиметровая бумага.
Подготовка реагентов к анализу. Перед использованием все реагенты и пробы необходимо привести к комнатной температуре (18—25 °С). Сыворотки, в которых ожидается концентрация прогестерона свыше 50 нг/мл, следует предварительно развести разбавителем сыворотки.
Ход определения. Закрепляют в штативе необходимое количество ячеек. Вносят по 25 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб (в параллелях) в соответствующие ячейки. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл конъюгата прогестерона-ПХ и по 50 мкл кроличьего антипрогестеронового реагента. Тщательно и аккуратно перемешивают в течение 30 с. Инкубируют при комнатной температуре (18—25 °С) на протяжении 90 мин. При помощи автоматического промывающего устройства исследуемые ячейки пятикратно промывают бидистиллированной водой. Остатки жидкости в ячейках удаляют, переворачивая и постукивая плашкой по фильтровальной бумаге. Вносят по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора в каждую ячейку, осторожно перемешивают в течение 5 с. Инкубируют при комнатной температуре (18—25 °С) 20 мин. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора. Осторожно перемешивают 30 с. Очень важно, чтобы голубая окраска полно-
458
стью перешла в желтую. Считывают абсорбцию на ридере при длине волны 450 нм в течение 15 мин.
По полученным результатам стандартов строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию гормона в исследуемых пробах сыворотки. При подсчете результаты предварительно разведенных образцов умножают на фактор разведения.
Клиническое значение. Прогестерон — женский половой гормон, который синтезируется желтым телом, частично надпочечниками и плацентой, у самцов — семенниками. Прогестерон обладает широким спектром воздействия на внутренние органы, но основное его влияние направлено на репродуктивные органы: тормозит сократительную функцию гладких мышц гениталий, содействует закрытию канала шейки матки и образованию в нем слизистой пробки при беременности, обеспечивает секрецию эндометрия, маточных желез, иммунную толерантность к эмбриону и детской части плаценты. Этот гормон является исключительно важным в регуляции функции надпочечников, яичников и плаценты во время беременности. Определение прогестерона используют для установления овуляции и изучения лютеиновой фазы, диагностики беременности на самых ранних стадиях.
Количество прогестерона зависит от физиологического состояния животных. В сыворотке крови коров в период стадии полового возбуждения его содержание колеблется в пределах 0,74—1,20 нг/мл, половой охоты — 0,36—0,56 нг/мл. В период стельности физиологический уровень гормона составляет 2,2—5,5 нг/мл, в том числе на 7-м месяце — 3,20—3,88, на 8-м — 2,82—3,36 нг/мл (А. Г. Нежданов с соавт., 1989). За 2—3 нед до отела содержание прогестерона резко уменьшается и во время отела определяется минимальное его количество. По уровню его в сыворотке крови на 21—24-й дни после осеменения можно определять стельность коровы (В. Д. Недвига, Г. Г. Харута, 2002), за 60—45 дней до отела — прогнозировать течение родов и послеродового периода (Г. Г. Харута, 1999).
В начале половой охоты кобыл содержание прогестерона в плазме крови составляет в среднем 1,23 ± 0,45 нг/мл, через 12 ч после овуляции — 0,75 ± 0,43, через 2 дня после окончания стадии полового возбуждения — 1,82 + 0,74, на 6—8-й дни полового цикла — 3,79 ± 0,95, на 11-14-й дни - 4,23 ± 1,4, а на 15—17-й дни — 3,21 ± 1,39 нг/мл.
Наивысшая концентрация прогестерона в плазме крови кобыл бывает на 2-м и 3-м месяцах жеребости (7,12 ± 2,10 и 6,81 ± 1,15 нг/мл), на 4—6-м месяцах содержание его уменьшается с 5,24 + 0,82 до 2,80 ± ± 0,40 нг/мл, а на 7—11-м увеличивается с 3,63 ± 0,65 до 5,64 ± ± 0,76 нг/мл (Д. В. Повалюк, 2001).
