Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Реактивы: 96 микротитрационных ячеек, покрытых козьими антикроличьими IgG;
референс-стандарты тестостерона — 6 флаконов по 0,5 мл с концентрациями 0,0, 0,1, 0,5, 2,0, 6,0 и 18 нг/мл. Готовы к использованию;
кроличий антитестостероновый реагент (розового цвета) — 1 флакон (7 мл);
конъюгат тестостерона и ПХ (голубого цвета) — 1 флакон (12 мл);
тестостероновые контроли — 2 флакона по 0,5 мл с уровнями I и II. Готовы к использованию;
ТМБ-реагент — 1 флакон (11 мл);
455
стоп-раствор (кислота хлористоводородная) — 1 флакон (11 мл); деионизированная или бидистиллированная вода. Примечания. Материалом для исследования служит сыворотка или плазма без гемолиза и липидемии. Антикоагулянт — гепарин. Образец крови помещают в воду со льдом и тотчас центрифугируют, отделяют сыворотку или плазму, охлаждают в холодильнике или замораживают при минус 20 °С. Сыворотку или плазму хранят 1 день при комнатной температуре, 3 дня при 4—8 °С и 1 год при минус 20 °С. Оборудование: микроплашечный иммуноферментный анализатор (ридер); инкубатор-шейкер для микропланшет; автоматическое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки на 10, 50, 100 мкл и 1,0 мл; фильтровальная бумага или бумажные салфетки для просушивания стрипов; миллиметровая бумага.
Подготовка реагентов к анализу. Перед использованием все реагенты и пробы необходимо привести к комнатной температуре (18—25 °С). Сыворотки, в которых уровень тестостерона свыше 18 нг/мл, следует развести разбавителем сыворотки.
Ход определения. Закрепляют в штативе необходимое количество ячеек. Вносят по 10 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб (в параллелях) в соответствующие ячейки. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл конъюгата тестостерона ПХ и по 50 мкл кроличьего антитестостеронового реагента. Тщательно и аккуратно перемешивают в течение 30 с. Инкубируют в инкубато-ре-шейкере при 37 °С на протяжении 90 мин. При помощи автоматического промывающего устройства исследуемые ячейки 5 раз промывают бидистиллированной водой. Остатки жидкости в ячейках удаляют, переворачивая и постукивая плашкой по фильтровальной бумаге. Вносят в каждую ячейку по 100 мкл ТМБ-хромо-генного раствора, осторожно перемешивают в течение 5 с. Инкубируют при комнатной температуре (18—25 °С) 20 мин. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора. Осторожно перемешивают 30 с. Очень важно, чтобы голубая окраска полностью перешла в желтую. Считывают абсорбцию на ридере при длине волны 450 нм в течение 15 мин.
По полученным результатам стандартов строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию гормона в исследуемых пробах сыворотки. При подсчете результаты предварительно разведенных образцов умножают на фактор разведения.
Клиническое значение. Тестостерон — это наиболее активный мужской половой гормон, который вырабатывается главным образом интерстициальными клетками семенников; у самок — в надпочечниках, фолликулах, желтом теле, однако в 10—15 раз меньшем количестве. Секрецию тестостерона стимулируют го надо -тропные гормоны: фолликулотропин и лютеотропин. У самцов тестостерон специфически действует на развитие и функцию орга-
456
нов размножения, созревание спермиев и сохранение их жизнеспособности, развитие вторичных половых признаков. Кроме того, повышает основной обмен, усиливает синтез белков (оказывает анаболическое действие).
Повышение уровня тестостерона наблюдают при патологии ги-поталамогипофизарной системы, опухолях семенников и яичников, гиперплазии надпочечников.
При недостаточной секреции тестостерона, фолликулотропина (ФСГ), лютеотропина (ЛГ) развивается гипогонадизм. Различают первичный и вторичный гипогонадизм. Причинами первичного являются врожденные аномалии, которые сопровождаются недостаточным развитием семенников и мошонки, двусторонний крипторхизм или орхит, инфекционный эпидидимит баранов. Вторичный гипогонадизм вызывает недостаточная секреция гонадотропних гормонов — ФСГ и ЛГ.
В сыворотке крови коров в период половой охоты содержание тестостерона составляет в среднем 116,8 + 9,0 пг/мл (В. С. Шипи-лов с соавт., 1987), на 7-м месяце стельности 241,4 ± 40,7 пг/мл (К. Г. Дашукаева, 1992), за месяц до отела 6,0—7,0 нмоль/л и через 15—30 дней после отела — 3,2—3,5 нмоль/л (В. И. Еременко, 2000).
9.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INCCIUA)
Принцип. Метод основан на конкурентном связывании прогестерона исследуемой сыворотки и конъюгата прогестерона-ПХ (меченного пероксидазой хрена) с постоянным количеством кроличьего антипрогестерона. В ячейки, покрытые антикроличьими IgG, добавляют стандарты, контроли и исследуемые пробы сыворотки, конъюгат прогестерона-ПХ и кроличий антипрогестероно-вый реагент. Во время инкубации при комнатной температуре (18—25 °С) известное количество меченного пероксидазой хрена прогестерона конъюгирует с эндогенным прогестероном в стандарте, пробе и контроле за определенное число мест связывания на специфических антителах к прогестерону. При этом количество связанного меченного пероксидазой прогестерона обратно пропорционально содержанию эндогенного прогестерона в исследуемой сыворотке.
