Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кондрахин И.П. -> "Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики" -> 212

Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.

Кондрахин И.П., Архипов А.В., Левченко В.И., Таланов Г.А., Фролова Л.А., Новиков В.Э. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики: Справочник. Под редакцией Сайтаниди В.Н. — М.: Колос, 2004. — 520 c.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка): metodvetkllabdia2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 206 207 208 209 210 211 < 212 > 213 214 215 216 217 218 .. 246 >> Следующая


Подготовка реагентов к анализу. 1. Моющий раствор: моющий концентрат развести бидистиллированной водой в соотношении 1:10.

2. Кальцитониновый антител-биотиновый конъюгатный раствор: кальцитонин-биотиновый конъюгатный концентрат развести в аналитическом буфере D (1:50). Для полной плашки на 96 проб необходимо отобрать точно 220 мкл кальцитонин-биотинового конъюгатного концентрата и 11 мл аналитического буфера D.

Примечание. Реагент необходимо разводить не более чем за 10—15 мин до начала исследования.

453

3. Стрептавидин-энзимный конъюгатный раствор: стрептави-дин-энзимный конъюгатный концентрат развести в аналитическом буфере D в соотношении 1:50 соответственно количеству используемых ячеек. Для полной плашки на 96 проб необходимо 220 мкл концентрата развести в 11 мл аналитического буфера D.

Примечание. Реагент разводят за 5—10 мин до начала исследования.

4. Микротитрационные ячейки: отобрать необходимое количество ячеек для исследований. Неиспользуемые ячейки поместить в пакет и тщательно его закрыть.

Ход определения. В используемые ячейки вносят по 100 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб сыворотки (в параллелях) и добавляют в каждую ячейку по 100 мкл кальцитонинового анти-тел-биотинового конъюгатного раствора. Ячейки инкубируют на протяжении 60 мин, встряхивая в шейкере микроплат (500—700 встряхиваний в 1 мин) при комнатной температуре (22—25 °С). После инкубации ячейки 5 раз промывают при помощи автоматического промывающего устройства, используя по 350 мкл моющего раствора. На последнем этапе используют двойную аспирацию (двойная откачка содержимого из одной лунки). При необходимости удаляют остатки жидкости, переворачивая плашку со стрипами на фильтровальную бумагу. Полуавтоматической пипеткой в каждую ячейку вносят по 100 мкл стрептавидин-энзимного конъюгатного раствора. Инкубируют в инкубаторе-шейкере при том же режиме (22—25 °С, 500—700 встряхиваний в 1 мин) 30 мин. Аспирируют и пятикратно промывают плашку моющим раствором по 350 мкл. Осушают ячейки на фильтровальной бумаге. В каждую ячейку вносят по 100.мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют 10—12 мин (22—25 °С, 500—700 встряхиваний в 1 мин), избегая попадания на плашку прямых солнечных лучей. Пипеткой добавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора (0,2 M раствор серной кислоты) для остановки цветной реакции. Плашку со стрипами помещают в иммуноферментный анализатор (ридер) и в режиме двойного излучения (вначале при 450 нм, затем при 620 нм) считывают абсорбцию растворов в ячейках (не позднее 30 мин после добавления стоп-раствора).

По полученным значениям стандартов строят стандартную кривую, по которой определяют концентрацию кальцитонина в исследуемых пробах сыворотки.

Примечание. Все стандарты кальцитонина представлены в пг/мл.

Для перевода в пмоль/л необходимо пг/мл х X 0,29 = пмоль/л.

Клиническое значение. Кальцитонин продуцируют па-рафолликулярные клетки (С-клетки) щитовидной железы и в понятие «тиреоидные гормоны» обычно не включается. Он не содержит йода и представляет собой полипептид из 32 аминокислотных остатков. Кальцитонин непосредственно влияет на костную ткань

454

и почки, где расположены его рецепторы, соответственно на остеокласты и на клетки тонкого сегмента восходящего колена петли Ген-ле и начала дистальных извитых канальцев. Он снижает уровень кальция в крови, когда тот превышает 2,5 ммоль/л. Тормозя активность остеокластов; кальцитонин угнетает резорбцию костей, что сопровождается гипокальциемией, гипофосфатемией и снижением активности щелочной фосфатазы. В почках кальцитонин увеличивает экскрецию кальция и фосфора.

Секрецию кальцитонина в физиологических условиях регулирует, по-видимому, только уровень кальция в сыворотке крови. Сведения о содержании кальцитонина в сыворотке крови животных ограничены. У клинически здоровых коров кальцитонина в сыворотке крови содержится 4,11 ± 0,13 пг/мл, у больных послеродовой гипокальциемией несколько ниже (И. Ф. Гаджаев, 1986).

9.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATION INC., США)

Принцип. Метод основан на конкурентном связывании тестостерона исследуемой сыворотки и конъюгата тестостерона-ПХ с постоянным количеством кроличьего антитестостерона. В ячейки, покрытые антикроличьими IgG, вносят по 10 мкл тестостероновых стандартов, контролей и исследуемых проб сыворотки, добавляют 100 мкл конъюгата тестостерона-ПХ и 50 мкл кроличьего антитес-тостеронового реагента. Инкубируют при 37 °С. Во время инкубации известное количество меченного ПХ тестостерона конкурирует с эндогенным тестостероном в стандарте, пробе или контрольной сыворотке за определенное число мест связывания на специфических антителах к тестостерону. При этом количество связанного меченного пероксидазой тестостерона обратно пропорционально содержанию эндогенного тестостерона в исследуемой сыворотке. Несвязанный конъюгат меченого тестостерона вымывают из ячеек. После этого в ячейки добавляют ТМБ-реагент. Развитие окраски прекращают добавлением стоп-раствора (кислоты хлористоводородной) и измеряют абсорбцию на ридере при длине волны 450 нм.
Предыдущая << 1 .. 206 207 208 209 210 211 < 212 > 213 214 215 216 217 218 .. 246 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed