Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Примечание. Все стандартные растворы приведены в мкМЕ/мл.
Для перевода в мМЕ/л необходимо мкМЕ/мл х X 1,0 = мМЕ/л.
Клиническое значение. ТТГ секретируется аденогипо-физом. Он стимулирует поглощение щитовидной железой йодида из крови, усиливает синтез тиреоглобулина и его распад с высвобождением Тз и Т4 в кровь. Секреция тиреоидных гормонов после выделения ТТГ возрастает уже через несколько минут. Уровень ТТГ в крови менее 5 мМЕ/л (1—4 нг/мл, или 0,6—3,8 мкг/л) на протяжении суток не меняется, и поэтому даже разовое определение его дает полезную клиническую информацию. Продукция ги-пофизарного ТТГ, в свою очередь, находится под контролем гипо-таламических гормонов — стимулирующего тиреотропин-рилизинг гормона (ТРГ) и ингибирующего соматостатина.
442
TTT является маркером при оценке функционального состояния щитовидной железы. В основе регуляции секреции ТТГ лежит механизм обратной связи: высокие концентрации T3 и T4 ингиби-руют, а низкие стимулируют секрецию ТТГ.
При гипертиреозе синтез и секреция ТТГ в гипофизе по принципу обратной связи блокированы высокими уровнями T3 и T4: количество ТТГ в крови менее 0,2 мИЕ/мл или гормон в крови не определяются. Введение T3 быстро снижает концентрацию ТТГ. Аналогичное действие оказывает и T4, но для этого требуется доза в 10 раз больше, чем T3, а торможение длится в 10 раз дольше.
9.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ К0РТИ30ЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)
Принцип. Метод основан на конкуренции между немеченым антигеном и энзим-меченым антигеном на определенное количество связей с антителом. Количество энзим-меченых антигенов, связанных с антителами, обратно пропорционально концентрации немеченого исследуемого.
Реактивы: 96 микротитрационных ячеек (12 стрипов), внутренние стенки которых покрыты козьей антикроличьей глобулино-вой сывороткой;
кортизол-антисыворотка (голубая) — 1 флакон (11 мл) содержит кроличью антикортизоловую сыворотку в протеиновом (BSA) буфере с нертутным консервантом;
кортизол-стандарты — 1 флакон (0,5 мл), обозначенный А, содержит 0 мкг/дл кортизола; 7 флаконов (по 0,5 мл каждый), обозначенные В—Н, содержат кортизол в протеиновом буфере (BSA) с нертутным консервантом в концентрациях 0,5, 1,5, 4,0, 10,0, 20,0, 40,0 и 60 мкг/дл;
кортизол-контроли — 2 флакона (по 0,5 мл каждый) с уровнями I и II содержат кортизол низкой и высокой концентрации в протеиновом буфере сыворотки с нертутным консервантом;
кортизол-энзимный конъюгатный концентрат — 1 ампула (0,3 мл) содержит раствор кортизола в протеиновом буфере с нертутным консервантом. Перед исследованием разводят конъюгат-ным растворителем;
конъюгатный растворитель — 1 флакон (11 мл) содержит основанный на протеине буфер с нертутным консервантом;
ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит раствор тетраметилбензидина (TM Б) в цитратном буфере с водорода пероксидом;
моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли с неионным детергентом. Перед использованием разводят в 10 объемах деионизированной или бидистиллированной воды;
443
стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 M раствор серной кислоты;
бидистиллированная вода.
Примечание. Все реагенты и пробы перед началом анализа должны быть приведены к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешаны. Пониженная температура реагентов и проб дает заниженные результаты оптической плотности. Сыворотку (плазму) крови, свободную от гемолиза, можно хранить при 2—8 °С 24 ч или более длительное время при минус 20 °С.
Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Stat Fax-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм и 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Stat Fax-2200, настраиваемый на 500—700 движений в 1 мин; автоматическое промывающее устройство Stat Fax-2600; полуавтоматические дозаторы на 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).
Подготовка реагентов к анализу. 1. Энзимный конъюгатный раствор: кортизол-энзимный конъюгатный концентрат развести в чистой посуде конъюгатным растворителем в соотношении 1:50 соответственно количеству используемых ячеек. Если используется вся плашка, необходимо отмерить точно 200 мкл кортизол-эн-зимного конъюгатного концентрата и 10 мл конъюгатного растворителя. Готовят непосредственно перед использованием.
2. Моющий раствор: 100 мл концентрата моющего раствора в колбе растворить в 900 мл бидистиллированной воды.
3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.
Ход определения. В используемые ячейки микропланшета дозатором вносят по 25 мкл стандартов, контролей и сыворотки крови. Добавляют по 100 мкл свежеприготовленного энзимного конъюгатного раствора. Осторожно встряхивают штатив с ячейками 5—10 с, перемешивая содержимое ячеек. Дозатором (лучше многоканальным) вносят в каждую ячейку по 100 мкл кортизол-антисы-воротки. Микротитрационную плашку со стрипами помещают в инкубатор-шейкер для инкубации (~ 25 °С) в течение 45 мин, одновременно встряхивая со скоростью 500—700 встряхиваний в 1 мин. Используя автоматическое моющее устройство, аспириру-ют и пятикратно тщательно промывают каждую ячейку моющим раствором по 350 мкл, избегая попадания пузырьков воздуха. После этого удаляют остатки жидкости с ячеек, переворачивая плашку на фильтровальную бумагу. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора. Закрывают микроплан-
