Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек, покрытых анти-чТТГ-антителами;
ТТГ-стандарты — 1 флакон (А, 1 мл) содержит 0 мкМЕ/мл, 5 флаконов по 0,5 мл (B-F) с концентрациями 0,15, 0,70, 2,00, 7,50 и 22,00 мкМЕ/мл ТТГ в сыворотке свиньи с нертутным консервантом;
ТТГ-контроли — 2 флакона по 0,5 мл каждый. Уровни I и II содержат высокую и низкую концентрации ТТГ в сыворотке свиньи с нертутным консервантом;
аналитический буфер B-I флакон (11 мл) содержит протеиновый буфер с нертутным консервантом;
ТЛТ-антител-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон из темного стекла (0,3 мл) содержит анти-чТТГ-антитела, конъ-югированные с энзимами пероксидазы хрена в протеиновом буфере с нертутным консервантом (перед использованием необходимое
440
количество концентрата в зависимости от количества исследуемых образцов растворяют в конъюгатном растворителе;
ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит тетра-метилбензидин в цитратном буфере с пероксидом водорода;
моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферный солевой раствор с неионным детергентом. Перед использованием разводят в 10 частях деионизированной или бидистиллированной воды;
стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 M раствор серной кислоты;
бидистиллированная вода.
Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и, осторожно вращая, тщательно перемешать. Сыворотку крови хранят не более 24 ч в холодильнике при 2—8 °С. Для более длительного хранения исследуемые образцы замораживают и хранят при минус 20 °С и ниже. Не рекомендуется исследовать гемолизированные и липемичные образцы. Пробирку с кровью после взятия пробы тотчас помещают в воду со льдом и немедленно доставляют в лабораторию или отделяют сыворотку или плазму, или замораживают и в замороженном виде доставляют в лабораторию. Антикоагулянт — гепарин, а не ЭДТА. Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Stat Fax-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм и перенастраиваемый на 600 и 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Stat Fax-2200, настраиваемый на 500—700 движений/мин; автоматическое промывающее устройство Stat Fax-2600; полуавтоматические пипетки на 50 и 100 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).
Подготовка реагентов к анализу. 1. Антител-энзимный конъ-югатный раствор: антител-энзимный конъюгатный концентрат развести в аналитическом буфере (1 : 50), исходя из числа используемых ячеек (при использовании плашки на 96 ячеек 220 мкл ко-нъюгатного концентрата разводят в 11 мл аналитического буфера). Разводят его непосредственно перед исследованием.
2. Моющий раствор: 100 мл моющего концентрата растворить в 900 мл бидистиллированной воды. Раствор стабилен при комнатной температуре в посуде из темного стекла в течение 1 мес.
3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов, а остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.
Ход определения. Перед использованием все реагенты и пробы должны быть приведены к комнатной температуре (~ 25 °С).
441
Образцы сыворотки крови, стандарты и контроли необходимо исследовать в параллельных пробах.
В используемые ячейки микротитрационных стрипов пипеткой вносят по 50 мкл стандартов, контролей и исследуемой сыворотки крови. В каждую ячейку добавляют по 100 мкл свежеприготовленного антител-энзимного конъюгатного раствора. Микротитраци-онную плашку со стрипами помещают в инкубатор-шейкер для инкубации (t ~ 25 °С) в течение 90 мин, одновременно встряхивая со скоростью 500—600 движений в 1 мин. Используя автоматическое моющее устройство, пятикратно аспирируют и тщательно промывают каждую ячейку моющим раствором по 350 мкл, используя программу № 3 вошера. После этого удаляют остатки жидкости с ячеек, переворачивая плашку на фильтровальную бумагу. Полуавтоматической пипеткой (лучше использовать 8-канальную) в каждую ячейку добавляют по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют ячейки при комнатной температуре (~ 25 °С) в течение 10 мин, одновременно встряхивая в инкубаторе-шейкере со скоростью 500—600 движений в 1 мин.
По окончании инкубации в каждую ячейку пипеткой добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 M раствор серной кислоты) для прерывания реакции и развития окрашивания. Помещают плашку со стрипами в иммуноферментный анализатор (ридер) для измерения абсорбции раствора в ячейках при длине волны 450 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-раствора). Перед учетом абсорбции микротитрационных ячеек необходимо установить прибор на «0» в соответствии с нулевым стандартом (Blanc). При возможности для более точного измерения абсорбции необходимо установить прибор на измерение двойного излучения при длине волны 450 нм с последующей перенастройкой на 600 или 620 нм.
Полученные значения стандартов TTT используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию тиреотропина в исследуемых образцах.
