Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Приготовление раствора для ферментативной реакции. 3,6 мл дистиллированной воды залить в коническую пробирку, добавить
411
в нее 0,4 мл реактива «Субстрат» (концентрат) и 0,02 мл реактива ФДА. Перемешать, нанести маркировку «субстрат».
Проведение ферментативной реакции. По 0,2 мл раствора «субстрат» внести во все ячейки. Планшет накрыть крышкой и выдержать в течение 45 мин в темноте при комнатной температуре.
Остановка реакции. Во все ячейки внести по 0,05 мл рабочего раствора серной кислоты, планшет аккуратно встряхнуть и через 10 мин приступить к измерению оптической плотности окрашенного комплекса.
Учет реакции. Планшет поместить в фотометр, навести на ячейку «0» и выставить ноль прибора. Последовательно перемещая планшет по ячейкам, измерить оптическую плотность раствора в каждой ячейке и записать результат. По двум значениям оптической плотности для каждого варианта найти среднюю величину. Среднее значение оптической плотности в «КО» принять за 100 % связывания. Для каждого варианта рассчитать процент связывания по формуле
% связывания = Среднее оптич. плотности варианта . т Среднее оптич. плотности «КО»
По значениям процентов связывания для вариантов Kl, К2, КЗ на оси ординат и соответствующим значениям десятичных логарифмов концентрации (мкг/мл) рабочих растворов T-2-токсина для калибровки (—2,00; —2,70; —3,40) на оси абсцисс провести калибровочную прямую от 10 до 90 % связывания. По значениям процентов связывания для остальных вариантов с помощью калибровочной прямой найти значения логарифмов концентраций T-2-токсина в рабочих растворах [(с) мкг/мл] и рассчитать его содержание в пробах по формуле
(с) мкг/кг - (с) мкг/мл • 105.
Клиническое значение. Обнаружение в кормахT-2-ток-сина в количествах, превышающих 100 мкг/кг корма, служит основанием для постановки предварительного диагноза на T-2-токси-коз. Однако окончательный диагноз может быть поставлен только после изучения клинической картины интоксикации и результатов патологоанатомического вскрытия. Кроме того, результаты химико-аналитического исследования целесообразно подтвердить постановкой кожной пробы на кролике. Для этого на выстриженную кожу кролика наносят концентрированные ацетоновые или эфирные экстракты из кормов. При наличии в пробах T-2-токсина в количествах, способных вызвать клиническую картину интоксикации, через 2—3 дня после нанесения развивается резкая гиперемия, отек с утолщением кожи и последующим образованием язв.
Определение дезоксиниваленола в зерне с применением обращен-но-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Метод разработан Г. П. Кононенко, Н. А. Соболевой, Е. В. Зотовой,
412
А. Н. Леоновым, С. Н. Ланиным, В. В. Петренко (1995) и рекомендован отделением ветеринарной медицины РАСХН.
Дезоксиниваленол (вомитоксин, 3,7,15-триокси-12,13-эпоксит-рихотец-9-ен-8-он) относится к классу высокотоксичных мико-токсинов с ЛД50 для лабораторных животных 40—50 мг/кг. Мико-токсин продуцируют грибы Fusarium (F. qraminearum, F. culmorum). Ареал распространения грибов-продуцентов ограничивается южными регионами России. Образование микотоксина происходит на вегетирующих зерновых культурах при их поражении фузариозом, главным образом на пшенице и ячмене. Широкое распространение фузариоза зерновых культур имело место в 1980 г. в ряде провинций Канады, в 1982 г. в штате Канзас (США), в 1986 и 1987 гг. в Краснодарском крае России.
Принцип. Метод основан на экстракции микотоксина из размолотого зерна или муки смесью ацетонитрила и воды, колоночной очистке экстракта на смеси активированного угля и цеолита с последующим определением содержания микотоксина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектированием при длине волны 224 нм.
Реактивы: ацетонитрил (ч.);
вода дистиллированная;
спирт изопропиловый (ч.);
тетрагидрофуран (ч.);
калия гидроксид гранулированный;
дезоксиниваленол, аналитический стандарт.
Оборудование: хроматограф жидкостный микроколоночный «Милихром» или аналогичный; мельница МРП-1; делитель БИС-1; испаритель ротационный ИР-1; насос водоструйный; баня песочная с терморегулятором; фильтры бумажные с синей лентой; уголь активированный марки «АГН», техн.; колонка хроматогра-фическая 62 X 2 мм с фазой Сів «Nucleceil C^»; колонка для очистки экстрактов [воронка типа ВФ-2, на дно которой закладывается 5—6 кусочков фильтровальной бумаги с толщиной слоя 0,2—0,3 см, затем засыпается слой адсорбента (смесь активированного угля и цеолита 1:1) 1 г и алюминия оксид 4 г]; прибор для перегонки растворителей; колбы стеклянные разные; цилиндры мерные.
Ход определения. 25 г размолотого зерна (муки) помещают в колбу на 250 мл и заливают 125 мл раствора для экстракции (ацетонитрил-вода 5:1 по объему). Колбу встряхивают круговыми движениями и оставляют на 16 ч при комнатной температуре. Экстракт фильтруют в другую колбу через бумажный фильтр с синей лентой. Экстракт чистят на колонке. Для этого 20 мл экстракта порциями пропускают постепенно через колонку. Экстракт собирают, упаривают досуха в вакуум-ротационном испарителе при 50 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл смеси перегнанного тетра-гидрофурана и воды, которая используется в качестве подвижной фазы в жидкостной хроматографии. 10 мкл раствора вводят в жид-
