Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
натрия тиосульфат, 25%-ный водный раствор;
гексан (х. ч.);
спирт этиловый ректификат; бром; индоксилацетат (ч. д. а.); броминдоксилацетат (ч. д. а.);
калий железисто-синеродистый, 1,5%-ный водный раствор;
калий железисто-синеродистый, 20%-ный водный раствор;
буферный раствор, pH 8,69: 2,1 мл ортофосфорной, 2,3 мл уксусной и 2,47 г борной кислот помещают в колбу на 1 л и доводят до метки дистиллированной водой. К 100 мл указанной смеси добавляют 65 мл 0,2 н. раствора NaOH, который готовят растворением 0,8 г NaOH в 100 мл дистиллированной воды.
Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота, уток или кур (свежезамороженную печень можно хранить в морозильной камере холодильника 4 мес). Для приготовления фер-
391
ментного раствора 1 г печени растирают в ступке с 9 мл буферного раствора, фильтруют через вату. К 1 мл полученного гомогената добавляют 4 мл буферного раствора. Приготовленный препарат используют для опрыскивания пластинок. Применяют свежеприготовленный раствор.
Основной стандартный раствор ФОП готовят путем растворения 10 мг пестицида в 100 мл ацетона (100 мкг/мл). Из этого раствора готовят на ацетоне рабочие стандартные растворы от 0,01 до 0,5 мкг/мл.
Проявляющий реактив: 10 мг индоксилацетата или 5 мг бро-миндоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, добавляют 10 мл дистиллированной воды, 2 мл 1,5%-ного водного раствора железисто-синеродистого калия, 2 мл 2%-ного водного раствора железисто-синеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят перед опрыскиванием.
Оборудование: камера для хроматографирования; камера для опрыскивания пластинок; пластинки для хроматографии «Си-луфол» производства Чехии; отечественные пластинки «Армсорб» на фольге или стекле; «Плазмохром» на полимере; круглодонные и грушевидные колбы на шлифах на 25, 50 и 100 мл; пипетки на 1,5 и 10 мл; эксикаторы; воронки делительные на 250 и 500 мл; мерные колбы на 25 и 50 мл; баня водяная; вакуум-ротационный испаритель ИР-1; термостат; ступки керамические; компрессор или баллон с азотом или сжатым воздухом для распыления проявляющего реактива; пульверизаторы стеклянные; микрошприц на 100 мкл; микропипетки до 0,1 мл; шуттель-аппарат.
Ход определения. Юг измельченной ткани (печень, почки, мышцы) помещают в колбу с притертой пробкой и заливают 30 мл ацетона. Колбу встряхивают на шуттель-аппарате в течение 1 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в другую колбу. Остаток в колбе промывают 10 мл ацетона и фильтруют через тот же фильтр. К фильтрату добавляют 40 мл дистиллированной воды, и колбу на 20 мин помещают в морозильную камеру бытового холодильника. Охлажденную смесь фильтруют через плотный ватный томпон в делительную воронку. Остаток в колбе промывают 10 мл холодной смеси ацетон-вода (1:1) и объединяют с фильтратом. Пестициды из смеси ацетон-вода реэкстрагируют в 40 мл хлороформа, встряхивая делительную воронку в течение 2 мин.
После разделения слоев нижнюю фазу фильтруют через бумажный фильтр с помещенным на него безводным натрия сульфатом в фарфоровую чашку или колбу вакуум-ротационного испарителя. Реэкстракцию повторяют. Хлороформные экстракты объединяют и упаривают досуха в токе воздуха или с помощью вакуум-ротационного испарителя. Сухой остаток растворяют в 5 мл этанола (В. В. Карнаухов, 1987).
На пластинки «Силуфол» или «Плазмохром» наносят не более 30 мкл раствора экстракта, подготовленного для хроматографиро-
392
вания. На линию старта в том же объеме наносят стандартные растворы ожидаемых ФОП концентрацией 0,5 мкг/мл, или 15 нг в пробе. Пластинки помещают в камеру для хроматографирования, в которую за 30 мин до начала разделения заливают подвижный растворитель, который необходимо предварительно подобрать, используя стандартные растворы пестицидов. Для антио и фосфами-да может быть рекомендована подвижная система бензол-ацетон (3:2). Величина Rf пестицидов на «Силуфоле» соответственно составит 0,8 и 0,5. Для хлорофоса система гексан-ацетон (1:1) при величине Rf 0,3 при определении валексона, дурсбана, карбофоса, метафоса, метилнитрофоса, фталофоса в качестве подвижного растворителя может быть использован хлороформ.
После подъема фронта растворителя на высоту 10 см пластинки вынимают и сушат при комнатной температуре. После этого проводят активацию пестицидов: пластинки опрыскивают водным раствором брома или воздействуют на них УФ-лучами. При определении хлорофоса пластинку опрыскивают водным раствором аммиака. При применении в качестве активатора водных растворов брома через 15 мин после увлажнения пластинки избыточный бром удаляют путем легкого опрыскивания пластинки 2,5%-ным раствором натрия тиосульфата. Активацию пестицидов УФ-лучами осуществляют облучением пластинки с помощью лампы ПРК-4 с расстояния не более 20 см. При активации хлорофоса водным раствором аммиака его смешивают с 4 частями воды. Раствором пластинку опрыскивают до слабого увлажнения, после чего выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре. Под действием щелочи хлорофос переходит в ДДВФ, который обладает более высокой антихолинэстеразной активностью.
