Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
0,1 н. раствор натрия гидроксида (NaOH). Готовят из фиксана-ла, перед применением его титр проверяют 0,1 н. раствором кислоты хлористоводородной (HCl).
Оборудование: микробюретки на 2 и 5 мл; колбы на 50 и 100 мл; стаканчики или конические колбочки; пипетки на 5 и 10 мл; капельница.
Ход определения. В стаканчик или коническую колбочку наливают 10 мл профильтрованного содержимого рубца и добавляют из капельницы 1—2 капли 1%-ного раствора фенолфталеина. В кислом растворе индикатор не изменяет цвета. При титровании из микробюретки 0,1 н. раствором натрия гидроксида цвет изменяется до розово-красного. Общая кислотность содержимого рубца определяется количеством миллилитров 0,1 н. раствора натрия гидроксида, необходимого для титрования 1 л (1000 мл) содержимого рубца (ед. титра). 1 ед. титра (ET) соответствует концентрации кислот в 1 ммоль/л.
Расчет общей кислотности ведут по формуле
v= А-1000 0,1
с
где X — общая кислотность, ммоль/л (ET); А — количество 0,1 н. раствора NaOH, мл; 1000 — пересчет на 1 л; 0,1 — количество миллиграмм-эквивалентов щелочи •в 1 мл 0,1 н. раствора, ммоль; С — объем содержимого рубца, взятого для исследования, мл.
У клинически здоровых коров с нормальной ферментацией содержимого общая кислотность составляет 8—25 ммоль/л (ET). В гиперацидном состоянии (ацидоз, непроходимость сычуга, антиперистальтика) общая кислотность возрастает до 70 моль/л (ET).
21*
323
6.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТИСТЫХ ВЕЩЕСТВ В СОДЕРЖИМОМ РУБЦА
Определение общего азота в жидкости рубца. Для определения концентрации общего азота в рубцовой жидкости используют метод Кьельдаля.
Принцип. Метод базируется на способности органических соединений под воздействием кипящей серной кислоты окисляться до углекислоты и воды. Азот белковых и близких к ним соединений при этом гидролизируется, образуя в присутствии воды ионы аммония. Метод выполняют в три этапа: минерализации (сжигания) пробы, отгонки аммиака и его определения.
Реактивы: концентрированная H2SO4;
33%-ный раствор NaOH;
0,01 н. (0,01 моль/л) раствор NaOH;
0,01 н. (0,005 моль/л) H2SO4;
индикатор Таширо;
катализатор, состоящий из K2SO4 (Na2SO4), меди сульфата и селена в соотношении 100:10:5.
Оборудование: колбы Кьельдаля на 100 мл; плитка для сжигания образцов; прибор Кьельдаля для перегонки пробы; пипетки; бюретки на 10 мл; индикаторная бумага.
Ход определения. В колбу Кьельдаля осторожно наливают 1 мл рубцового содержимого. Туда же приливают 5 мл H2SO4 (концентрированной) и 1 г катализатора. Колбы ставят под углом сначала на слабое, а потом на сильное пламя, не доводя до сильного кипения. Сжигание прекращают, когда жидкость в колбе станет прозрачной.
В перегонную колбу переносят всю сожженную пробу. В приемную колбочку наливают 10—20 мл 0,01 н. раствора серной кислоты и 3—4 капли индикатора Таширо, подставляют ее под стеклянную трубочку, соединенную с холодильником аппарата Кьельдаля, опуская конец трубки в раствор кислоты.
Отмеривают 30—40 мл 33%-ного раствора NaOH и заливают его через воронку в перегонную колбу. Включают нагреватель и начинают отгонять пробы. Во время кипячения выделяется аммиак, который вместе с парами воды после прохождения через холодильник попадает в приемник и связывается с серной кислотой. Отгонку продолжают 15—30 мин до нейтральной реакции, проверяя индикаторной бумагой.
Содержимое приемной колбы титруют 0,01 н. раствором NaOH до изменения малинового цвета на зеленый.
Расчет количества общего азота в пробе ведут по формуле
х = (А - ?)-0,14-100,
где X — количество общего азота в 100 мл рубцовой жидкости, мг; А — количество 0,01 н. раствора H2SO4 в приемнике, мл; Б — количество 0,01 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование, мл; 0,14 — количество азота, связываемое 1 мл 0,01 н. раствора серной кислоты, мг.
324
Расхождение результатов параллельных определений не должно превышать 2—3 %.
Концентрация общего азота, который представлен белком микроорганизмов, нераспавшимся протеином корма, конечными и промежуточными продуктами азотистого обмена (аммиак, свободные аминокислоты, пептиды и др.), в цельном содержимом рубца коров может составлять 100—300 мг/100 мл, в рубцовой жидкости — от 50 до 240 мг/100 мл, у овец — 120—350 и 60—250 мг/100 мл соответственно.
Источники: 25, 29.
Определение белкового и небелкового (остаточного) азота в жидкости рубца. Определение небелкового азота. Небелковый азот в рубцовой жидкости определяют методом Кьельдаля. Предварительно необходимо осадить белки. С этой целью используют соли тяжелых металлов, поскольку трихлоруксусная кислота недостаточно полно осаждает растительные белки и полипептиды.
Реактивы: 0,3 н. (0,15 моль/л) раствор Ba(OH)2;
5%-ный ZnSO4;
фенолфталеин (индикатор);
остальные реактивы те же, что и при определении общего азота.
Оборудование: центрифуга; колбы Кьельдаля на 100 мл; прибор Кьельдаля для перегонки пробы; пипетки, бюретки; электроплитка.
Ход определения. Для осаждения белков в центрифужную пробирку наливают рубцовую жидкость определенного объема (например, 2 мл). Туда же добавляют такое же количество 0,3 н. раствора Ba(OH)2 и аналогичный объем 5%-ного раствора цинка сульфата. Реактивы предварительно должны быть оттитрованы, т. е. должны точно нейтрализовать друг друга по фенолфталеину (объем на объем). Смесь тщательно перемешивают и центрифугируют 15 мин при 3000—5000 мин \ 3 мл центрифугата, соответствующего 1 мл рубцовой жидкости, переносят в колбу Кьельдаля, заливают 3 мл концентрированной серной кислоты. Сжигание пробы и отгонку аммиака проводят так же, как и при определении общего азота. Учитывая, что концентрация небелкового азота в содержимом рубца не превышает 60 мг/100 мл, в приемную колбу достаточно налить 10 мл 0,01 н. раствора серной кислоты.
