Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
№
0,1 моль/л раствор
Дистиллиро-
Содержание уксусной ки-
Активность холин-
про-
уксусной кислоты,
ванная вода,
слоты в калибровочной
эстеразы,
бирки
мл
мл
пробе, мкмоль
мкмоль/с • л
і
2
8
4
22,2
2
4
6
8
44,5
3
6
4
12
66,7
4
8
2
16
89,0
5
9
I
18
100,0
235
так же, как калибровочную, но вместо стандартных растворов используют дистиллированную воду. Из экстинкции холостой пробы вычитают экстинкцию калибровочной пробы. Полученную величину экстинкции откладывают на оси ординат, количество мкмоль уксусной кислоты — на оси абсцисс. Линейная зависимость калибровочного графика сохраняется в пределах от 0 до 110 мкмоль/с • л. Примечания. 1. Активность холинэстеразы заметно не изменяется при хранении сыворотки в герметически закрытых пробирках в холодильнике при температуре 2—6 0C в течение 4 дней. 2. Исследование должно проводиться тотчас после доставки образцов крови в лабораторию. 3. Ложноотрицательные результаты вследствие ингибирования активности холинэстеразы дают цитраты (антикоагулянты), оксалаты, фториды. 4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови возможно методом с субстратом бутирилтиохолина йодидом. Источники: 19, 43.
Клиническое значение. Холинэстераза расщепляет аце-тилхолин на холин и уксусную кислоту. Фермент синтезируется в печени, поэтому степень активности холинэстеразы во многом зависит от функционального состояния этого органа.
У здоровых животных активность холинэстеразы сыворотки крови ориентировочно составляет 150—300 мкмоль/ч ¦ мл (42—84 нмоль/с ¦ л). Уменьшение активности холинэстеразы отмечается при хроническом гепатите, циррозе печени, отравлениях фосфорорганическими средствами. Активность холинэстеразы низка у новорожденных животных.
Определение активности уреазы в сое. Реактивы: индикатор феноловый красный. В 10 мл этилового спирта растворяют 50 мг индикатора;
калия фосфат двузамещенный (K2HPO4) и калия фосфат одноза-мещенный (KH2PO4) (ч. д. а., х. ч.) перекристаллизованные;
0,05 н. раствор K2HPO4. 8,7 г вещества растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 1 л;
0,05 н. раствор KH2PO4. 6,8 г вещества растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 1 л;
мочевина (карбамид);
эталонные буферные растворы готовят в колбочках с притертыми пробками, как указано в таблице 36.
Оборудование: ступка фарфоровая; сито с отверстиями диаметром 0,25 мм; колбочки с притертыми пробками.
Ход определения. Измельчают соевый шрот или зерно сои, просеивают на сите. В каждую из семи пробирок вносят по 10 мл эталонного буферного раствора с соответствующими pH и по 2 капли раствора индикатора. В две параллельные пробирки
236
36. Эталонные буферные растворы
N° колбочки
Вносимые компоненты
pH раствора
раствор № 3, мл
раствор N° 4, мл
1
61,1
38,9
7,00
2
66,6
33,4
7,10
3
72,0
28,0
7,20
4
80,8
19,2
7,40
5
87,0
13,0
7,60
6
91,5
8,5
7,80
7
94,7
5,3
8,00
вносят по 0,2 г измельченного соевого шрота или соевой муки, по 10 мл буферного раствора № 1 (pH 7,00), по 0,3 г мочевины и по 2 капли раствора индикатора. Пробирки со смесью выдерживают в водяной бане при температуре 20—25 °С в течение 30 мин, периодически осторожно встряхивают. Появившуюся в пробирках окраску сравнивают с эталонной в семи буферных растворах, находят pH испытуемой пробы.
Активность уреазы определяют по формуле
X = рН| - рН0)
где jc — активность уреазы, pH; pH j — величина pH раствора испытуемого образца; рНо — pH исходного буферного раствора (pH 7,00).
В параллельных пробах корма допускаются расхождения pH не более ±0,05.
Клиническое значение. В соевых кормах, не подвергшихся соответствующей термической обработке, имеются ингибиторы трипсина. Поедание таких кормов птицей и свиньями вызывает расстройство пищеварения, диарею и другие нежелательные последствия. Поэтому в таких кормах перед их скармливанием определяют активность уреазы и выражают ее величиной pH. В соевой муке и шроте для птиц pH должен быть не более 0,1.
Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-глута-милтрансферазы) в сыворотке крови с помощью набора реактивов. Принцип. у-Глутамилтранспептидаза (ГГТ) катализирует реакцию переноса L-глутаминового остатка с хромогенного субстрата на глицилглицин. При этом высвобождается w-нитроанилин, оптическую плотность которого измеряют фотометрически. Активность фермента определяют по приращению оптической плотности раствора кинетическим методом или методом постоянного времени. Активность фермента наиболее высока в почках, поджелудочной железе, печени и предстательной железе.
Реактивы: субстрат 200 мг L-глутамил-и-нитроанилина;
2,47 г буферной смеси (глицилглицин 1,26 г, трис 1,21 г);
3,0 мл стандартного 5 моль/л раствора и-нитроанилина;
237
дополнительный реактив — 10%-ная уксусная кислота.
Оборудование: фотоэлектроколориметр или спектрофо-к метр, длина волны 400—430 нм.
Приготовление рабочих растворов. 1. Буферный раствор, pH 8,1. 2,47 г буферной смеси растворяют в 70—80 мл дистиллированной воды в мерной колбе на 100 мл и доливают водой до метки. Раствор стабилен при хранении в холодильнике. 2. Субстратно-буферный раствор. Отбирают 40 мг субстрата и растворяют в 18 мл дистиллированной воды, добавляют 17 мл буферного раствора и доводят до температуры 37 °С. Раствор устойчив при 15—25 °С в течение 10 ч.
