Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
33. Разведения натрия пирувата для построения калибровочного графика
пробирки
Рабочий калибровочный раствор натрия
пирувата, мл
0,03 моль/л раствор пиро-фосфата, мл
Бидистил-лирован-ная вода, мл
Содержание пировиноградной кислоты в калибровочной пробе
Активность
лдг,
нмоль/с ¦ Л
мкг
MKM ОЛЬ
1
0,1
0,8
0,5
0,88
0,01
334
2
0,2
0,8
0,4
1,76
0,02
668
3
0,4
0,8
0,2
3,52
0,04
1336
4
0,6
0,8
—
5,28
0,06
2004
5
0,8
0,6
—
7,04
0,08
2672
Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидрозина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют дистиллированную воду. Пересчет активности ЛДГ на микромоли пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С проводят по формуле
X= С - 30 • 4/88,
где X — активность ЛДГ, нмоль/с • л; С — микрограммы пировиноградной кислоты в калибровочной пробе; 30 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки; 4 — коэффициент пересчета на 1 ч инкубации; 88 — масса 1 мкмоля пировиноградной кислоты, мкг.
Прямолинейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотности сохраняется от 0 до 10 ммоль ч/мл. Линейная зависимость между концентрацией натрия пирувата и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/с • л.
Примечания. 1. Сыворотка крови должна быть свободной от гемолиза. 2. Для исследования рекомендуется использовать свежую сыворотку. 3. В качестве антикоагулянта не следует использовать соли щавелевой кислоты, так как они ингибируют фермент. 4. В сыворотке активность ЛДГ на 40 % выше, чем в плазме. 5. Сыворотку хранят при комнатной температуре не более 7 дней в закрытых пробирках.
15 — 4196
225
Хранение сыворотки при температуре от +4 до —20 °С делает ее непригодной для анализа.
Разделение изоферментов ЛДГ проводят электрофоретическим методом на пленках из ацетата целлюлозы.
Источник: 29.
Клиническое значение. ЛДГ ускоряет реакцию окисления молочной кислоты в пировиноградную. Нормальная величина ЛДГ от 0,6 до 4,5 микромолей пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С, или 160—1200 нмоль/с-л. Повышение активности ЛДГ отмечают при поражении миокарда, печени и почек, причем при болезнях сердца преимущественно повышается активность изоферментов ЛДГ] и ЛДГ2, а при паренхиматозных гепатитах и нефритах — изофермента ЛДГ5. У новорожденных животных активность ЛДГ выше, чем у взрослых.
Незначительное повышение активности ЛДГ отмечают при анемиях, физиологическом напряжении, отравлениях, тиреотоксикозе, злокачественных опухолях. Все заболевания, при которых отмечается некроз тканей, сопровождаются повышением активности ЛДГ. Увеличение активности изофермента ЛДГ] характерно для поражения сердца. При болезнях печени преимущественно увеличивается активность изоферментов ЛДГ5 и ЛДГ4 и уменьшается активность ЛДГ] и ЛДГ2.
Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу ?-глицерофосфата (метод Бодански). Принцип. Под действием фермента сыворотки крови натрия ?-глицерофос-фат подвергается гидролизу с освобождением неорганического фосфора. По его количеству определяют активность фермента.
Реактивы: глицерофосфатный субстрат, pH 9,0 ± 0,1. 2,15 г натрия ?-глицерофосфата и 2,12 г 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты натриевой соли (мединал) растворяют в дистиллированной воде и доводят объем в мерной колбе на 500 мл до метки. Определяют pH буферного раствора. Хранят в холодильнике под слоем толуола 7—10 дней;
10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);
серная кислота концентрированная (плотность 1,84);
раствор аммония молибдата (ч. д. а.). 100 г вещества растворяют в 500 мл воды, подогретой до 50 °С. После охлаждения приливают 100 мл концентрированной серной кислоты, снова охлаждают и переносят в мерную колбу на 1 л, доливают дистиллированной водой до метки;
раствор аммония ванадата (ч. д. а.). 2,5 г вещества растворяют в 500 мл кипящей дистиллированной воды. Кипячение продолжают до тех пор, пока раствор не окрасится в желтый цвет. После охлаждения раствор переносят в мерную колбу на 1 л и доводят объем дистиллированной водой до метки;
реактив на фосфор. Смешивают растворы аммония молибдата и ванадата в равных объемах. Реактив годен 2 мес;
226
стандартный раствор фосфора основной. 0,439 г калия фосфата однозамещенного (х. ч.), высушенного над концентрированной серной кислотой, растворяют в 100 мл дистиллированной воды. В 1 мл раствора содержится 1 мг фосфора. Из него готовят рабочий стандартный раствор. Берут 5 мл основного раствора и доводят объем дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл до метки.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; эксикатор; электроплитка.
Ход определения. В центрифужные пробирки вносят по 2,5 мл ?-глицерофосфатного субстрата и ставят в термостат при 37 °С на 15 мин. На каждую пробу берут 2 пробирки (№ 1 и 2) и на серию исследований 2 пробирки на контроль (№ 3 и 4) и 2 пробирки на субстрат (№ 5 и 6). Через 15 мин в пробирку № 1 добавляют 0,5 мл сыворотки и продолжают нагревать все пробирки в термостате при 37 °С в течение 1 ч (точно). Пробы охлаждают. В пробирку № 2 вносят 0,5 мл сыворотки, в № 3 и 4 — по 0,5 мл дистиллированной воды, в № 5 и 6 — по 0,5 мл рабочего стандартного раствора фосфора.
