Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
222
32. Разведения для построения калибровочного графика
№ пробирки
Калибровочный раствор натрия пирува-та, мл
Дистиллированная вода, мл
Пировиноградная кислота
Активность ферментов АлАТ, AcAT, нмоль/с-л
мкг
мкмоль
1
0,05
0,55
4,4
0,05
278
2
0,10
0,50
8,8
0,10
556
3
0,15
0,45
13,2
0,15
834
4
0,20
0,40
17,6
0,20
1112
5
0,25
0,35
22,0
0,25
1390
меряют против холостой пробы, в которую вместо калибровочного раствора добавляют воду. Калибровочная кривая линейна до величины экстинкции 0,3. Источник: 43.
Примечание. Метод Райтмана—Френкеля положен в основу заводских наборов реактивов для определения активности AcAT и АлАТ, выпускаемых ЧНПП «Фи-лист-диагностика» (Украина), фирмой «Ла-Хема» (Чехия) и др. Исследование активности ферментов в сыворотке или плазме должно быть проведено в день взятия крови. Клиническое значение. Аминотрансферазы переносят аминогруппы от аминокислот к кетокислотам. AcAT и АлАТ не обладают органной специфичностью, однако определение их активности используют для диагностики болезней печени и сердца.
При гепатитах резко повышается активность АлАТ, поражение миокарда сопровождается преимущественно возрастанием активности AcAT. Нами (И. П. Кондрахин) отмечено резкое повышение активности AcAT и АлАТ при травматическом перикардите у коров. У здоровых животных активность AcAT составляет 0,1—0,55 микромолей пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С, или 28—154 нмоль/с • л. Активность АлАТ в норме составляет 0,1—0,48 микромолей пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С, или 28—134 нмоль/с • л.
При синдроме цитолиза гепатоцитов в несколько раз повышается активность не только АлАТ, но и AcAT. Активность этих ферментов в сыворотке крови определяют главным образом для диагностики болезней печени и сердца, при которых происходит распад клеток.
Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по реакции с 2,4-динитрофенилгидрозином (метод Севела—Товаре-ка). Принцип. L-лактат под действием фермента сыворотки в присутствии никотинамид-аденин-динуклеотида (НАД) окисляется в пируват, который определяется по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидрозином.
223
Реактивы: 0,45 моль/л раствор натрия лактата. В мерную колбу на 100 мл вносят 5 мл 80%-ной молочной кислоты (коммерческой), добавляют 2 моль/л раствор натрия гидроксида (ч. д. а., х. ч.) до получения pH 7,5 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике;
0,03 моль/л раствор натрия пирофосфата, pH 8,8. 6,69 г натрия пирофосфата (Na4P2Oy • 10H2O, ч. д. а.) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, добавляют 1 моль/л раствор соляной кислоты до получения pH 8,8 и доводят объем дистиллированной водой до 500 мл. Стабилен 1 мес при хранении в холодильнике;
раствор НАД. Готовят из расчета 3 мг НАД на 1 мл дистиллированной воды. Раствор стабилен 1 мес при хранении в холодильнике;
раствор 2,4-динитрофенилгидрозина. 19,8 мг реактива растворяют в небольшом количестве 1 моль/л соляной кислоты при нагревании в водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором соляной кислоты до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года;
0,4 моль/л раствор натрия гидроксида;
1 моль/л раствор соляной кислоты;
калибровочный раствор пировиноградной кислоты. 11 мг кристаллического натрия пирувата растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки бидистиллированной водой. 1,0 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты;
рабочий калибровочный раствор готовят разведением основного раствора в 10 раз бидистиллированной водой. 1 мл рабочего раствора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; колбы мерные.
Ход определения. 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при 37 °С, добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора натрия пирофосфата и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора натрия лактата, предварительно прогретых при 37 °С, и инкубируют смесь при 37 °С в течение 15 мин.
Тотчас же после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидрозина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора натрия гидроксида, перемешивают. Через 10 мин измеряют экс-тинкцию раствора на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.
Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.
224
Расчет активности проводят по калибровочному графику. Активность лактатдегидрогеназы выражают в микромолях пировиноградной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки в течение 1 ч при 37 °С, или нмоль/с • л.
Построение калибровочного графика. Из рабочего калибровочного раствора натрия пирувата готовят ряд разведений, как указано в таблице 33.
