Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
интерпретации. В определении степенных показателей уравнения большое
значение имеет установление наличия на кривых определенных геометрических
признаков: максимумов и минимумов, перегибов, их положения относительно
асимптоты, вогнутости, выпуклости и др. Поэтому очень важно достоверно
знать форму кривой в широком интервале концентраций лиганда, а не только
вблизи пересечения с осями. Предложенный в гл. 4 метод степенного
преобразования основан на анализе таких свойств кривых, как вогнутость и
выпуклость. Применяя этот метод для определения степенных параметров
уравнения скорости Na, К-АТФазной реакции при каждом значении параметра
г, авторы тщательно проверяли, как изменялась ошибка экспериментальных
точек в процессе линеаризации. Если каждой экспериментальной точке Vi
соответствовала средняя квадратичная ошибка а;, то после степенного
преобразования получали новое множество точек
Уi = 0 /Ч)1/г; о2 Ш = (yjr) (s.Jvj2.
Линеаризация кривой подразумевает определение того значения параметра г,
при котором отклонение функции t/,- от регрессионной линии Yi минимально.
Используя метод наименьших квадратов, минимизируют взвешенную среднюю
квадратичную ошибку:
i-i
103
где Wi= (\foi{y))2 - заданные положительные веса. Линейность
регрессионной линии оценивали путем сравнения величины
N
МП V (у/ _ Г,.)2
г -________-------------
- N
(N-2) 2 0/(°/М)2 1=1
со стандартным значением критерия Фишера при степенях свободы vi = N-2 и
\2=N (т-1), где т - число идентичных измерений.
В подобных расчетах обычно используют ряд допущений, о которых всегда
следует помнить. В первую очередь это касается выбора концепции ошибки.
Изучение природы экспериментальной ошибки показало, что начальные
скорости ферментативных реакций, измеренные в постоянных условиях, не
всегда распределены с постоянной дисперсией, как обычно предполагают (т.
е. не гомоске-дастичны). Не всегда выполнимо также предположение о
постоянстве относительной ошибки. Изучение структуры ошибки для
реакционной системы глутатион-Б-трансферазы, глутатиона и 3,4-дихлор-1-
нитробензола, например, показало, что экспериментальная ошибка возрастала
вместе с начальной скоростью и дисперсия (определенная по одинаковым
измерениям) описывалась полиномом от v (P. Askelof et al., 1976):
-^<г>)=АГ0+Л>+/^2 или степенной функцией: o2{v)=K^-\-KxvK*.
Для Na, К-АТФазы также специально была изучена зависимость
экспериментальной ошибки от скорости реакции. На основе анализа 1600
экспериментальных точек было обнаружено, что абсолютная величина среднего
значения отклонения возрастает с увеличением удельной активности линейно,
т. е. относительная ошибка постоянна. Величина относительной ошибки не
превышала 3% от удельной активности Na, К-АТФазы (Г. А. Зурабишвили и
др., 1986).
С осторожностью следует подходить к процедуре взвешивания. Сравнивая
различные способы расчета весов, А. Сторер и сотрудники пришли к выводу,
что следует избегать каких-либо обобщений и не выбирать метод взвешивания
a priori, а решать проблему для каждой серии экспериментов отдельно.
Авторы подчеркивают, что если использовать метод определения весов с
помощью измерений идентичных образцов, считая весом средней величины
обратную дисперсию, то для каждой точки следует иметь по меньшей мере
пять идентичных измерений (A. Storer et al., 1975). В рассмотренных выше
случаях Na, К-АТФазы это условие было соблюдено.
Статистический анализ данных в ферментативной кинетике всегда привлекал
большое внимание ученых (В. Mannervick, 1975; С. Lam et al., 1977; М.
Feraudi et al., 1977). Особо следует отметить
104
работу Дж. и И. Петтерсенов (G. Pettersen, I. Pettersen, 1970), в которой
впервые был предложен метод оценки корректности аппроксимации
кинетических кривых дробно-рациональными функциями. В работе была развита
идея о том, что если варьировать концентрацию одного субстрата в
условиях, когда фермент не претерпевает агрегации и [S]^>[/o], то
уравнение скорости имеет вид:
w=Sd'[5]7i>№
1=1 I 1-0
Аппроксимацию следует проводить последовательно функциями 1: 1, 2 :2,
3:3, 4 :4 и т. д., проверяя на каждой ступени с помощью /-теста,
оправдано ли увеличение числа параметров уменьшением суммы квадратов, а с
помощью /-теста оценивать значимость определяемых параметров. Хотя такой
подход является стандартным и широко используется в других областях,
применение этого метода в ферментативной кинетике вызывает ряд вопросов.
Например, каким образом зависит успешное применение теста от числа
экспериментальных точек, от ширины области концентраций субстрата, от
структуры ошибки? Нужно ли брать взвешенные или невзвешенные суммы
квадратов? Можно ли вообще отличить степень 4:4 от 3:3?
Попытки ответить на эти вопросы содержатся в работе Ф. Бур-гилло и
сотрудников (1983), авторы которой исследовали зависимость v (5) для ряда
ферментативных механизмов. Они имитировали кривые для 13 механизмов,
используя несколько распределений констант скорости и варьируя при этом
