Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
Определение пит было проведено в условиях, которые отражают различные
режимы работы Na, К-АТФазной системы, выявляемые при исследовании
зависимости скорости от концентрации А^АТФ н свободных ионов АТФ и Mg2+.
Эти режимы классифицировали по величине отношения свободного АТФ и Mg2+
(K=MfA) и по концентрации комплекса А^АТФ (5<1 мМ или 5>1 мМ).
Соответственно можно выделить несколько режимов (/-IV): 1 - избыток
свободного АТФ(А<С1, S>\)\1I - избыток свободногоMg2+ 1, 5>1); III-малые
концентрации субстрата (S<1, ?.<1); IV-малые концентрации субстрата
("S<1, A^l).
Тогда на основе определения параметров пит зависимости v = =f(x) при
различных соотношениях S, А и М можно придать дробно-рациональной функции
ц(х) более конкретный вид. Для режимов / и III (Я<С 1):
1/х, ММОЛЬ-' //л, ММОЛо
Рис. 24. Зависимость (о)~|/г от х-1 при различных фиксированных
концентрациях S, А и М, мМ ([КС1] = = 130 мМ):
S А М pH
а 1,61 1,99 0,07 7,73
б 2,92 3,09 0,01 6.2
в 0.41 0,39 0,09 7,70
г 0.41 0,39 0,39 7,8
д 2.92 0,03 0,31 6.2
е 1,61 0,07 1,99 7.73
я 2.53 0.48 0,48 6.2
Рис. 25. Зависимость (и)~1/3 от х при различных фиксированных
концентрациях S.
(мМ), ([КС1]=
А = 1
и М, мМ):
I
2 00
U00 х, ммоль
а
б
в
S А Л! pH
1.9 1,0 1.0 6.2
2.5 0.5 3.5 6.2
2.5 0.5 0.5 7.8
Для режимов II и IV (Я^1):
рх
х4 2 a'ixl
V=-^7--------------.
pr+7
2 р>'
t-*0
6.3. Определение числа К-центров Na, К-АТФазы
Рассмотрим Na, К-АТФазную активность как функцию от концентрации калия.
Обозначим концентрацию ионов через у и попытаемся определить для
зависимости v=f(y)
ру
У 2 V
sy
2 h"'
i-О
параметры пу и ту (Sy=ny-{-my-\-py). Условия реакционной среды подобраны
согласно соображениям, высказанным в предыдущем разделе. Это означает,
что определение пу нужно проводить при высоких концентрациях Na+ (140
мМ), а определение ту - при [NaCl] = 10 мМ. Использовать более низкие
концентрации не удалось из-за резкого возрастания относительной ошибки
измерения. Соотношение MgATO, Mg2+ и АТФ было подобрано таким образом,
чтобы Na, К-АТФаза могла работать в одном из трех режимов: 1) Я<1, 5> 1
мМ; 2) 5>1 мМ; 3) А=М<5.
На рис. 26 показаны результаты экспериментов, проводившихся при
сравнительно малых концентрациях свободного АТФ, но при различных
значениях pH, S и М. Характерной чертой этих опытов является то, что в
отсутствие К+ в реакционной среде, независимо от других параметров, Na,
К-АТФазная активность достоверно отличается от нуля, УоФО. Это означает,
что для зависимости v=f(y) параметр пу=0.
Определим новую зависимость v-Vo=f(y), которая в обратных координатах
будет иметь вид:
sv
У 2 Ро $ш~1 _________о_________________
РУ Sy
2 °юу~1-"о 2 foy~l /-1 /=/>+1
где Dfo = ccipo-схоРг- Для этой зависимости пу= 1. Действительно, как
видно из рис. 26, во всех случаях при [К+]^5 мМ. зависимость имеет строго
линейный характер. Следует подчеркнуть, что все пря-
93
мые пересекаются приблизительно в одной точке при отрицательных значениях
функции и аргумента (l/t/~0,6 мМ-1). Аналогичные результаты получены при
уменьшении фиксированной концентрации NaCl до 36 и 48 мМ, с той разницей,
что прямые пересекались при положительных значениях функции и аргумента.
Рис. 26. Зависимость 1/(и-и0) от l/t/(u0~3,5±0,7 мкмоль Фн/ч на 1 мг
белка); при различных фиксированных концентрациях S, А, М (мМ)
([NaCI]=142-146 мМ):
S А М pH
а 2.5 0,5 3,5 6,2
6 2.5 0,5 0,5 8.4
в 2,5 0,5 0,5 7,7
г 1.6 0,08 2,0 7,6
a 0,4 0,2 02 7,8
е 0,6 0,3 0,3 7,8
ж 1.6 0,4 0,4 7,8
Иная картина наблюдается при исследовании зависимости v = =f(y) при
наличии в реакционной среде избытка свободного АТФ или нефосфорилирующих
аналогов АТФ. Во-первых, в отсутствие ионов калия Na, К-АТФазная
активность достоверно не отличается от нуля. Во-вторых, для зависимости
v=f(y) получаем пу = 2 (рис. 27).
В одной серии экспериментов в реакционную среду, содержавшую эквимолярные
концентрации АТФ и MgCb и высокие концентрации NaCl (pH 7,78), добавляли
0,17 мМ аденилилнмидодифос-фат или 0,2 мМ аденилилметилендифосфат (рис.
27, а и б). При этом предполагали, что свободный нефосфорилирующий аналог
и его магниевый комплекс могут конкурировать со свободным АТФ и А^АТФ за
нуклеотидные участки и одновременно сдвигать равновесие в сторону
образования избытка свободного АТФ. В результате этого сложного
перераспределения ожидали, что увеличится содержание ?А-формы (фермент -
свободный нуклеотид)
94
при одновременном уменьшении концентрации Z^S-формы, т. е. увеличится
вероятность "режима свободного АТФ" (Я<С1). Оказалось что в этих условиях
ntJ=2.
Во второй серии опытов избыток свободного АТФ был образован в результате
подбора отношения АТФ/МдС12 и pH. Был получен идентичный результат: пу =
2 (рис. 27).
Рис. 27. Зависимость (1 /г)-1/2 от 1 /у при различных фиксированных
концентрациях S, А и М, мМ ([NaCl] = 144- 150 мМ):
S А М pH
а 1.6 0,4 0,4 7,7
б 0,6 0,2 0,2 7.7
в 0.91 0,89 0,09 7,62
г 1,61 1,59 0,09 7,62
