Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
показала, что в обратных координатах в области 5=1 мМ наблюдается четко
выраженное изменение наклона (U"tt<C.0), тогда как в соседних областях
экспериментальные точки хорошо аппроксимируются прямыми линиями. Таким
образом, при любых соотношениях М/S, М/А и А/S при достаточно малых
значениях аргумента наблюдается отклонение кривых от линейности.
В заключение сформулируем условия, которые продиктованы формой
экспериментальных кривых при к=const и которые следует учитывать при
построении общей схемы вместе с условиями, перечисленными в предыдущем
разделе.
Условие 7. При фиксировании к-М/А в обратных координатах зависимость
Ux=f(t) является дробно-иррациональной функцией, которая не имеет
асимптоты и при больших значениях аргумента является монотонно
возрастающей, выпуклой функцией, стремящейся к бесконечности.
Условие 8. Форма кривых U%=f(t) при малых значениях аргумента зависит от
отношения к. При к~^ 1 кривая имеет форму монотонно возрастающей,
выпуклой функции, тогда как при малых значениях к превращается в
монотонно убывающую, вогнутую функцию.
5.3. Минимальная модель субстратной зависимости Na, К-АТФазы
В предыдущих разделах была описана форма различных экспериментальных
кривых, получаемых при фиксировании концентраций лигандов и их отношения.
Из этих данных следует, что минимальная модель Плеснера и соавторов может
объяснить форму кривых только при малых концентрациях субстрата (5<1 мМ).
Следовательно, модель следует расширить и согласовать с формой
экспериментальных кривых при больших концентрациях субстрата (5>1 мМ).
Расширение модели нужно начать с формы ОЕР (см. схему 1). Это
продиктовано следующими соображениями.
1. Существование формы SES и AES экспериментально не показано. Их
введение в схему существенно не изменит форму кри-
78
вых в области экстремально больших концентраций субстрата, так как
имеются каталитически активные формы МЕР, АЕР и SEP-, однако их наличие
радикально изменит форму кривых при экстремально малых концентрациях
субстрата.
2. Существование фосфорилированной формы и ее функциональное значение как
интермедиата Na, К-АТФазной реакции нельзя не учитывать при построении
кинетической схемы.
3. При замене последовательности необратимых ступеней ...ES-+EP-+EX... на
одну необратимую ступень ...ES-+EP... форма кривых не изменяется. Они
кинетически не отличимы (L. Plesner, I. Plesner, 1981). Следовательно,
необходимо добавить формы МЕР, SEP и АЕР. По аналогии необходимо также
рассмотреть добавление форм SMEP и МАЕР. Такой расширенный вариант
приведен на схеме 5.
Схема 5
Схема 5 представляет половину димерной системы, которая симметрична
относительно формы ОБО. Используя метод Кинга - Альтмана, для этого
варианта можно вывести расчетную зависимость U=f(t, А, М), где U=eQ/2v,
t= 1/S, е0 - суммарная кон-
79
центрация фермента. Введя обозначения для различных комбинаций
кинетических констант, уравнение скорости запишем в виде:
и=
1
krMM k%s k'SM\ kpAAS
Л*+ ~о +^'s-'l+-+*
и *\s
И
К
Кмо
b*J+
I и f 1 I 1 Af \ kpsMS f iW \ pA ж щд <
+4l+9+i^)i^v+i^ri^AM+
х('+'+-?г)('+Ш'+т^1$+
Kms l~*
+АЛ1+?>-^-(1+-г°
+"(|+,+?)[(Ч
AS
+
A
- 4 k% ^
{-QS2-f
SM
Km"s
¦)])
Следующим этапом является согласование экспериментальных и рассчитанных
по (5.1) кривых и "минимизация" модели. Для этого необходимо
преобразовать зависимость U=f(t, А, М) в функцию одного переменного и
сравнить ее с соответствующими экспериментальными кривыми, т. е.
необходимо исследовать формы расчетных зависимостей UA=f(t), Us=f{M)
и U),=f(t),
которые получаются при фиксировании М, A, S и Я,.
Рассмотрим внача ie область малых концентраций субстрата (S<l мМ).
I. При фиксировании концентрации свободных лигандов, М- =const и
y4=const, зависимость U=f(t, А, М) превращается в дробно-рациональную
функцию одного переменного, порядок которой выше единицы:
/ Т ^МО ^Af 1^ ^ 2
иМ =-------
аМ1* 1 аМ2i 2
! + Рл9* 2 + ••• + Рд^ 5
А1
А'2
А 5
аА1*~' + аА2^2 + • * • + "А5*-5
Эти обе функции имеют асимптоты и, следовательно, при достаточно малых
концентрациях субстрата будут представлены пря-
80
мой линией. В первом приближении наклон аппроксимирующих прямых можно
оценить следующими выражениями:
( М \( 1 м \
Um ^м ^ ^т - ^ У + Кщ А 2 + Кмо / .
At аму k\ (1 + q + Ml Kim)
Ks
Ml +
?) V 2 ^ Ka J
Эти расчетные зависимости хорошо согласуются с данными эксперимента (см.
рис. 17) и литературными данными (L. Plesner,
I. Plesner, 1981).
Без детального анализа числовых значений коэффициентов можно утверждать,
что при малых концентрациях субстрата модель, изображенная на схеме 5,
соответствует экспериментальным данным. Для окончательного утверждения
рассмотрим соотношение коэффициентов при фиксированном отношении к-М/А в
области малых концентраций.
2. При фиксировании отношения М/А зависимость U-f(t, А, М) превращается в
дробно-иррациональную функцию одного переменного:
,Т Рхр + Рл1/2*~1/2 + •.. + Рх7/2* 7/2
к~~ vi+(W_3/2+ ••• + азФ*"7/2
