Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
обратных координатах при различных кон- '?
центрациях свободного Mg?+ (мМ, цифры около Фиксирование концен кривых)
трации свободных ho-
о. 2
68
нов магния (Л1) применяли во всех кинетических исследованиях Na, К-
АТФазной системы, ставящих целью идентифицировать истинный субстрат. При
этом все исследователи пришли к единому мнению, что комплекс MgATO(S)
является истинным субстратом для Na, К-АТФазы, однако их выводы о роли
свободных ионов Mg2+ были диаметрально противоположного характера (Т.
Нехшп et al., 1970; J. Robinson, 1974; L. Plesner, I. Plesner, 1981).
Все измерения были проведены при сравнительно малых концентрациях
комплекса Л^АТФ (5^1 мМ), что вполне оправданно с точки зрения
классической кинетики. Наиболее тщательно эта зависимость исследована в
работе Л. Плеснера и соавторов (1981). Они использовали широкий диапазон
фиксированных концентраций свободного Mg2+ (0,06 мМ<М<9 мМ) и проводили
строгую статистическую обработку результатов.
Авторы данной книги проводили аналогичные эксперименты в более широком
интервале концентраций 5. Было получено, что в традиционной области
концентрации Л^АТФ (5^7 мМ) результаты принципиально совпадали с
результатами Плеснера и соавторов. Поэтому кинетическая модель этих
авторов была использована как исходная для дальнейшего анализа.
Необходимость дополнительных исследований, однако, была продиктована тем
фактом, что при больших концентрациях субстрата (S>1 мМ) зависимость
v=f(S) при фиксированном Mg2+ имела явно нелинейный характер (рис. 15).
Это не согласуется со схемой JI. Плеснера и соавторов (схема 1), из
которой следует, что при фиксированных концентрациях М в обратных
координатах линейность должна сохраняться и при больших 5.
МЕО кР°
Схема 1
Более тщательное исследование зависимости v=f(S, А, М)1 в различных
условиях позволило сделать ряд уточнений. На рис. 16-19 приведены
основные графики зависимости скорости Na,
1А - концентрация свободных ионов АТФ, М - концентрация свободных ионов
Mg2+, 5 - концентрация комплекса MgATO.
D
5
j__________
10 1/S
Рис. 16. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Ф"/ч на 1 мг
белка) от концентрации 5 (мМ) в обратных координатах при различных
концентрациях свободного АТФ (цифры около кривых обозначают концентрацию,
мМ)
А, ммоль А, ммоль
Рис. 17. Вторичный график зависимости 1/и = =/(1/5) (см. рис. 16). А-
зависимость наклона прямых (ф) (мг белка-ч-мМ/мкмоль Ф") от концентрации
А; Б - зависимость пересечения с осью ординат (У) (мг белка-ч/мкмоль Ф")
от концентрации А
К-АТФазы (и) от концентрации А, М и 5. Как видно на рис. 16, в области
0,1 мМ^5^1 мМ при А = const зависимость носит линейный характер.
Линейность сохраняется в достаточно широком диапазоне концентрации
свободного АТФ
(0,02 мД1^Л<с2 мМ). Прямые проведены методом наименьших квадратов, и
параметры прямых статистически обработаны.
В этих условиях зависимость наклона кривой от А проявляла четко
выраженную линейность (рис. 17, А), а зависимость точки пересечения от А
имела более сложный характер (рис. 17, Б). При малых концентрациях А
(=^0,2 мМ) отрезок, отсекаемый прямой, уменьшался при увеличении А, при
больших концентрациях достоверных измерений не наблюдалось. Это означает,
что при концентрации 0,2- 2 мМ свободный АТФ ведет себя как конкурентный
ингибитор, что совпадает с ранее высказанным предположением (Т. Нех-um et
al., 1970; J. Robinson, 1974).
При больших концентрациях МдАТФ, однако, происходит резкое изменение
картины (рис. 18). В обратных координатах наблюдается нелинейная
зависимость при 5>1 мМ. Кривые имеют вогнутую форму, и первая
Рис. 18. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Ф"/ч на 1 мг
белка) от концентрации 5 (мМ) в обратных координатах при различных
концентрациях А (цифры около кривых показывают концентрацию, мМ)
Рис. 19. Зависимость обратной величины Na, К-АТФазной активности от
концентрации Mg2+ (мМ) при фиксированных значениях S (мМ)
71
производная становится отрицательной. Таким образом, аномальное влияние
свободного АТФ на скорость ферментативной реакции при больших значениях S
указывает на более сложную роль АТФ как модификатора системы.
При фиксировании концентрации MgATO кривые имеют сложную форму (рис. 19).
Например, при S = 0,1 мМ зависимость 1/и = =f(M) имеет четко выраженный
экстремум и точку перегиба. Следует отметить, что при 5=const и
стремлении одного из свободных лигандов к нулю, концентрация второго
свободного лиганда возрастает. Этот процесс сопровождается уменьшением
ферментативной активности. Следовательно, в отсутствие одного из
свободных лигандов второй играет роль ингибитора и не может быть истинным
субстратом для Na, К-АТФазы.
Отклонение от линейности при M=const указывает, что модель, изображенная
на схеме 1, не является минимальной и ее следует расширить. Это означает
появление дополнительных участков связывания и новых ступеней в
кинетической схеме.
Новая модель должна быть обязательно построена на основе модели Плеснера.
