Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
точек новой зависимости F/G. Следовательно, относительная ошибка при
использовании вариантов 1а и 16 не изменяется, тогда как при
использовании варианта 2а (р = - 1 /п) уменьшается в п раз. Вариант 2а и
в этом случае имеет преимущество по сравнению с вариантами 1а и 16.
Подводя итог, можно заключить, что определение степенных параметров пят
основывается на том, что при r - п и г=т линия регрессии в рабочем
интервале концентраций максимально приближается к асимптоте функции.
Условием аппроксимации является стремление второй производной функции к
нулевому значению на всем рабочем интервале. Основываясь на (4.4), легко
показать, что при этом должно выполняться условие:
-Г&г -fО) (со - 1) = г (1П U)tt + [(1П U)t\2 = О,
где z=Injc; t=\/x.
Следует подчеркнуть, что это равенство должно выполняться не только в
отдельных точках t, но и на всем "рабочем" отрезке, поэтому параметр г
является функцией /. Перепишем условие следующим образом:
шг + со -(In U)tt
Тогда условие линеаризации участка кривой можно определить как
требование: 6R(t)/dt^.0.
Выше было показано, что границы рабочего интервала зависят от величины и
и от ошибки измерения. На практике определение конкретного рабочего
интервала основано на исследовании функции R(t).
Исследование субстратной зависимости
транспортных
АТФаз
5.1. Особенности субстратной зависимости АТФазных реакций
В гл. 5 исследование субстратной зависимости транспортных АТФаз проведено
на примере Na, К-АТФазы. Этому есть две причины: во-первых, авторы
располагают большим экспериментальным материалом именно по Na, К-АТФазе;
во-вторых, Na, К-АТФаза представляет собой самую сложную систему среди
транспортных АТФаз, так что кинетические методы, пригодные для ее
исследования, вполне могут быть использованы и для других АТФаз. Авторы
полагают, что многие особенности функционирования и регуляции Na, К-
АТФазы, выявленные с помощью кинетических методов анализа, будут
обнаружены также и при исследовании других транспортных ферментов.
При кинетическом исследовании АТФаз необходимо учитывать их специфическую
особенность: АТФ образует комплекс с ионами магния. Возникает два
вопроса: что является истинным субстратом для АТФаз (МдАТФ, АТФ или оба
лиганда вместе) и какую роль играют несубстратные компоненты системы в
регуляции АТФазной активности? Для Na, К-АТФазы эти вопросы приобретают
принципиальное значение.
На эти вопросы были предприняты попытки ответить двумя способами: прямым
измерением связывания лигандов и кинетическим анализом зависимости
скорости гидролиза и фосфорилирования от концентрации лигандов.
Результаты этих исследований можно суммировать в виде следующих основных
выводов.
1. Истинным субстратом для Na, К-АТФазы служит комплекс Mg АТФ. В
исследовании JI. Плеснера и соавторов (1981) показано, что гидролизуется
не только образовавшийся в растворе комплекс Mg АТФ, но и комплекс,
сборка которого происходит на ферменте. Однако необходимым условием
последнего является присоединение вначале АТФ, так как исходное
присоединение к ферменту Mg2+ вызывает образование "тупикового"
комплекса.
2. Не вызывает сомнения, что функциональная единица фермента может иметь
несколько нуклеотидсвязывающих участков с раз-
3*
67
личным сродством (J. Robinson, М. Flashner, 1979). Различают участки с
высоким сродством (порядка 100 мМ-1) и с низким сродством (порядка 1-10
мМ-1). Обычно участок с высоким сродством связывают с Na-формой фермента
(Е\), а участок с низким сродством - с К-формой фермента (?2). Не
установлено, однако, сосуществуют ли они одновременно, или появляются
последовательно, т. е. их место среди этапов молекулярного механизма Na,
К-АТФазы не определено. Тем не менее при расшифровке механизма Na, К-
АТФазной реакции необходимо исходить из возможности существования двух
или более нуклеотидсвя-зывающих участков.
3. Ионы Mg2+- один из компонентов образования субстрата Л/^АТФ, однако
эффект Mg+ имеет более сложный характер. Известно, что Mg2+ влияет на
определенные стадии реакции: Е\Р^Е2Р и Е{^±Е2. Кроме того, в
миллимолярных концентрациях Mg2+ ингибирует связывание нефосфорилирующих
аналогов АТФ (р-у-имидо-АТФ); аналогично Mg АТФ ионы Mg2+ ингибируют
АДФ/АТФ-обмен, увеличивают Ко,5 для Na+ (активатора фосфорилирования
фермента и Na-АТФазной реакции). Этот эффект не имитируется А^АТФ (J.
Robinson, М. Flashner, 1979). Все
вышеизложенное невозможно объяснить занятием субстратных участков ионами
Mg2+. Более вероятно, что для Mg2+ существует специальный участок
связывания, где Mg2+ может проявить свое действие мощного модификатора.
Следовательно, при расшифровке молекулярного механизма Na, К-АТФазы
необходимо исходить из возможности существования на функциональной
единице фермента участков связывания свободных ионов Mg2+.
Кинетические кривые обычно исследуют при фиксированных концентрациях
свобод-Рис. 15. Зависимость Na, К-АТФазной активности НОГО АТФ, Mg2+ и
(мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации S кпмппркгя МсАТФ (мМ) в
