Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
24
Ёсли оксиэтилтиаминпирофосфат (XIV) является промежуточным продуктом и при ферментативном декарбоксилировании пирувата, то он должен эффективно использоваться в соответствующих системах, заменяя пируват и тиаминпирофосфат. При постановке опытов с пируватдекарбоксилазой, выделенной из зародышей пшеницы, исходили из этого предположения, полагая, что каталитические количества декарбоксилазы должны высвобождать ацетальдегид из оксиэтнлтиамин-пирофосфата [314]. Оказалось, однако, что в указанных условиях ацетальдегид не образовывался. Постановка эксперимента предполагала высокую скорость соединения оксиэтилтиамннпирофосфата с ферментом и быстрое отщепление тиаминпирофосфата от фермента после высвобождения ацетальдегида. Скорость же отщепления, как показали проверочные опыты, оказалась чрезвычайно низкой [314, 315], что и явилось причиной неудачи опытов в такой постановке. При использовании фермента в относительно больших количествах стало возможно наблюдать образование ацетальдегида, причем его образовывалось тем больше, чем больше добавлялось в пробу пируватдекарбоксилазы. Этого следовало ожидать, учитывая низкую скорость отщепления кофер-мента.
Оксиэтилтиаминпирофосфат, полученный синтетически, был исследован и в других энзиматических реакциях. Ферментный препарат из Aerobacter aerogenes образует ацетоин из пирувата. Тот же самый продукт накапливался и при использовании оксиэтилтиаминпиро-фосфата вместо тиаминпирофосфата и пирувата [314], Как и при образовании ацетальдегида под действием декарбоксилазы зародышей пшеницы, ацетоин накапливался в количествах, пропорциональных добавленному ферменту. При добавлении в реакционную среду ферри-цианида (было известно, что в этих условиях происходит окислительное декарбоксилирование пирувата и образуется уксусная кислота) из оксиэтилтиаминпиро-фосфата образовывался ацетат, причем без фермента его образовывалось очень мало. Вышеприведенные данные указывали на то, что синтетически полученный оксиэтилтиаминпирофосфат, предполагаемый промежуточный продукт ферментативных превращений пирувата, участвует во всех исследованных реакциях и дает те же
25
самые продукты превращения, что и исходный субстрат— пировиноградная кислота.
Диоксмэ гилтнамиииирофосфат (AY)— производное тиаминпирофосфата, предполагавшееся в качестве промежуточною продукта в 1ранскетолазной реакции, 1ак-же был получен синтетически и подвергнут ферментативному изучению [234, 313, 314]. В этих опытах использовали апотранскетолазу пекарских дрожжей. Акцептором гликольальдегида служил рибозо-5-фосфат. Гли-кольальдегидный остаток, входящий в состав диокси-этилтиаминпирофосфата, был мечен по обоим углеродам. За реакцией следили по образованию седогептулозо-7-фосфата. Оказалось, что седогептулозо-7-фосфат образуется лишь в том случае, если был добавлен фермент. Радиоактивность обнаруживалась только в двух первых углеродных атомах седогептулозо-7-фосфата, причем в одинаковых количествах.
Во всех вышеприведенных экспериментах использовались синтетически полученные производные тиаминпирофосфата— оксиэтилтиаминпирофосфат и диокси-этнлтиаминпирофосфат. Требовалось, однако, доказать образование этих предполагаемых промежуточных соединений в процессе ферментативных реакций и возможность их дальнейших превращений, чтобы с уверенностью говорить о правильности выдвинутой гипотезы относительно химизма участия тиаминпирофосфата в ферментативных реакциях.
Как уже указывалось выше, при инкубации транскетолазы пекарских дрожжей с соответствующим субстратом образовывался «активный гликольальдегид»-ферментативный комплекс. Этот комплекс изолировали и показали, что он характеризуется способностью переносить гликольальдегидный остаток на соответствую щий акцептор, типичный для обычной транскетолазной реакции.
Таким образом, транскетолазная реакция искусственно проводилась в две последовательные стадии. Результаты проведенных экспериментов свидетельствовали в пользу того, что «активный гликольальдегид» является нормальным промежуточным продуктом в транскетолазной реакции.
Для точной идентификации структуры «активного гликольальдегида» требовались достаточно большие его
26
количества, а в системе транскетолаза+фруктозо-6-фос-фат его образуется мало. Поэтому была предпринята попытка найти более подходящий «источник» ферментативного получения «активного гликольальдегида». Таким «источником» оказалась система, состоящая из оксипирувата, тиаминпирофосфата и частично очищенного пируватдегидрогеназного комплекса из сердечной мышцы свиньи [155, 386]. Препараты «активного гликоль-альдегида», полученные двумя указанными способами, вели себя аналогично при исследовании методами бумажной хроматографии и электрофореза, а при их инкубации с рибозо-5-фосфатом (в присутствии дрожжевой траискетолазы) в обоих случаях образовывался седогептулозо-7-фосфат [390]. Использование оксипирувата в качестве источника получения «активного гли-кольальдегида» позволило иметь последний в таких количествах, что можно было приступить к изучению его структуры. Хольцер и сотр. [94] исходили из предположения, что структура «активного гликоль-альдегида» должна быть аналогичной структуре «активного ацетальдегида» и представлять собой тиамннпиро-фосфат, у которого водород во втором положении тиа-золового кольца заменен на диоксиэтнльную группу. Экспериментально такая структура была подтверждена следующим образом. Меченный по гликолевому остатку «активный гликольальдегид», полученный ферментативно указанным выше способом, дефосфорилировали, обрабатывали сульфитом (который расщепляет тиамин на две половины — пиримидиновую и тиазоловую) и затем исследовали электрофоретически. На электро-фореграмме обнаруживались две полосы. Одна была идентична (2-метил-4-амино-5-пиримидил) -метил-сульфонату— обычному продукту расщепления тиамина сульфитом. Вторая соответствовала тиазоловой части; в ней и была сосредоточена вся радиоактивность. Эту фракцию элюировали и затем хроматографировали. При этом на хроматограмме обнаруживали два пятна. Одно из них соответствовало свободному тиазоловому остатку и не содержало радиоактивности. Вся она была во втором пятне, которое соответствовало тиазоловому остатку, связанному с диоксиэтильной группой. Специфическая реакция была использована для точной идентификации места прикрепления диоксиэтильной группы
