Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Еще более наглядная картина получена с декарбо-ксилазным компонентом пируватдегидрогеназного комплекса, выделенного из мозга быка. Этот фермент взаимодействовал с тиаминпирофосфатом только в присутствии фосфата. Без него каталитическая активность фермента практически не восстанавливалась совсем, несмотря на наличие в среде высокой концентрации кофакторов [48].
Вообще нужно сказать, что фосфат оказывает на тиамииовые ферменты существенное влияние. Это с оче-
20У
видностыо следует уже из только что 'приведенного примера. Кроме того, в присутствии фосфата резко меняются физико-химические свойства изоформ транскетолазы [30, 277]. Показано его влияние на степень кооператив-ности при исследовании взаимодействия субстрата (пировиноградной кислоты) с пируватдекарбоксилазой пивных дрожжей [96].
Взаимодействие тиаминпирофосфата с апотранскето-лазой происходит как минимум по трем точкам и осуществляется за счет его тиаминовой части и двух фосфатных остатков [278]. Аналогично, по-видимому, взаимодействует кофермент и с другими тиаминовыми ферментами. Для пируватдекарбоксилазы показано непосредственное участие метильных групп, стоящих соответственно в четвертом положении тиазолового кольца и во втором положении пиримидинового кольца, а также l'-N-атома во взаимодействии кофермента с апофер-ментом.
Аминогруппа тиаминпирофосфата, по-видимому, не взаимодействует с молекулой белка, но расположена в непосредственной близости от ее поверхности [433].
С апотранскетолазой взаимодействие кофермента осуществляется при участии положительно заряженного тиазолового кольца тиаминпирофосфата [27, 63, 64]. При этом образуется комплекс с переносом заряда, играющий важную роль в осуществлении ферментом его каталитической функции [214, 279, 281, 284]. Связь транскетолаза — тиаминпирофосфат при образовании комплекса с переносом заряда если и стабилизируется, то очень несущественно. Значительно большего вклада следует, по-видимому, ожидать при взаимодействии с апотранскетолазой пиримидиновой части кофермента [424, 503].
Во всех случаях основную «якорную» функцию выполняет пирофосфатный остаток кофермента [21, 554]. Однако для транскетолазы его роль этим не ограничивается. В результате взаимодействия пирофосфатного остатка тиаминпирофосфата с апотранскетолазой создаются необходимые предпосылки для формирования каталитически активного центра фермента '[27, 63].
Возможно, аналогичную функцию пирофосфатный остаток выполняет в процессе 'взаимодействия тиамин-нирофосфата и с другими тиаминовыми ферментами.
210
В пользу этого говорит то, что тиамин и тиамин.монофос-фат способны связываться с апоферментом, однако каталитической функцией не обладают. В то же время известно, что указанные аналоги кофермента в такой же степени, как и сам кофермент, осуществляют превращение субстратов в условиях модельной системы [73, 309, 310, 313, 316, 357, 391].
В состав активного центра транскетолазы входят остатки гистидина и триптофана, участвующие во взаимодействии тиаминпирофосфата с апоферментом [22, 212, 213, 217, 281]. Наличие остатков триптофана предполагается и в активном центре пируватдекарбоксилазы пив ных дрожжей [61, 554]. Вхождение в состав активного центра остатков гистидина и их участие в связывании кофермента с белком показаны и для декарбоксилазного компонента пируватдегидрогеназного комплекса, выделенного из грудной мышцы голубя '[54, 67].
На том основании, что фенилглиоксаль ингибирует транскетолазу и снижает степень реконструкции холофермента нз апотранскетолазы и тиаминпирофосфата [424], авторы приходят к заключению, что наряду с остатками гистидина н триптофана в связывании кофермента с белком может принимать участие остаток (или остатки) аргинина.
Все тиаминовые ферменты, по крайней мере те, которые исследованы к настоящему времени, содержат в своем составе сульфгидрильные группы [25, 65, 78, 209, 213, 242, 294, 363, 464, 478, 557]. В количественном содержании сульфгидрильных групп наблюдаются существенные различия. Их относительно мало, например, в транскетолазе пекарских дрожжей [25, 213] и пируват-декарбоксилазе пивных дрожжей [99, 517], но много (до 30 на молекулу фермента) в пируватдекарбоксилазном компоненте 'пируватдегидрогеназных комплексов, выделенных из грудной мышцы голубя [65] и сердечной мышцы свиньи [294].
В исследованиях с пируватдекарбоксилазой показано, что сульфгидрильные группы данного фермента необходимы для связывания субстрата — пировиноградной кислоты [439], но не участвуют в связывании тиаминпирофосфата [99]. Предохранение ферментов тиаминпирофосфатом от ингибирующего действия на них сульфгидрильных реагентов и снижение числа титруемых
211
групп при наличии в среде кофермента [65] объясняется скорее общей стабилизацией белковой молекулы, чем непосредственным взаимодействием тиаминпирофосфата с ее сульфгидрильными группами.
Стабилизирующая функция тиаминпирофосфата показана со многими тиаминовыми ферментами при самых разнообразных внешних воздействиях на них: при тепловой денатурации [2, 78, 268], кислотной инактивации [2], действии сульфгидрильных реагентов [65], протео-литических ферментов [216]. Третичная структура при взаимодействии белковой молекулы с коферментом, очевидно, существенно не меняется. По крайней мере различий в содержании упорядоченных структур в апо- и холоферменте, при использовании доступных в настоящее время методов исследования, обнаружено не было [2, 211, 255, 294, 518].
