Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Нельзя исключить и такую возможность, что субъединицы транскетолазы более лабильны, чем димерная форма (глава II). В процессе проведения экспериментов по седиментационному равновесию фермент длительное время (около суток) находился при комнатной температуре в условиях низкой его концентрации в растворе. Это могло явиться причиной частичной денатурации субъединиц, что, в свою очередь, могло привести к потере кофакторами способности взаимодействовать с такими субъединицами и влиять на их ассоциацию с образованием димерной формы фермента. Косвенным подтверждением этого может служить то, что транскетолаз-ная активность, измеренная в конце проведения опытов по седиментационному равновесию, оказывалась заниженной по сравнению с исходной.
В одной из последних работ, выполненных в лаборатории Сейбла [119], опыты по седнментацпонном равновесию ставили не при комнатной температуре (как те, что описывались выше), а при 5°. В таких условиях распада холотранскетолазы на субъединицы не наблю далось. Это можно объяснить тем, что более низкая температура, во-первых, благоприятствует смещению равновесия форм транскетолазы в сторону образования димера, а во-вторых, повышает стабильность мономерной формы фермента и сохраняет их нативные свойства.
202
Нативная молекула нируватдскарбоксилазного компонента пируватдегидрогеназного комплекса грудной мышцы голубя способна спонтанно диссоциировать с образованием компонента с половинным молекулярным весом. Обе белковые фракции (исходный фермент и фракция, образовавшаяся в процессе его диссоциации) характеризуются каталитической активностью, лишь незначительно различающейся по абсолютной величине [68]. Это как будто бы указывало на то, что каталитическую функцию может выполнять не только нативная молекула фермента, но и отдельные ее функциональные единицы (состоящие каждая из двух полипептидных цепей — а и Р). Следует, однако, учесть, что 'при определении ферментативной активности в систему добавляли кофакторы, которые способны переводить мономерную форму тиаминовых ферментов в димерную. Нельзя исключить, что в данном случае реализуется именно эта возмож ность и *в действительности в обеих белковых фракциях, при измерении их каталитической активности, мы имеем дело с нативной формой фермента, представленной двумя функциональными единицами. Тем более показано, что хотя отдельные функциональные единицы (типа а, Р) способны связываться с липоилтрансацетилазой и в присутствии липоилдегидрогеназы при этом образуется пируватдегидрогеназный комплекс, но каталитической активностью он не обладает. Активность выявляется только в том случас, если в формировании комплекса участвует форма фермента, имеющая структуру ар, ар, т. е. состоящая из двух функциональных единиц.
С другой стороны, диссоциация пируватдекарбоксилазы пекарских дрожжей на субъединицы в слабощелочной среде сопровождается потерей ферментативной активности [177]. В тех же условиях пируватдекарбо-ксилазный компонент пируватдегидрогеназного комплекса Е. coli также распадается на две идентичные субъединицы [142, 531], которые могут быть отделены от исходной формы фермента с помощью гель-фильтрации на сефадексе. При этом оказалось, что ферментативная активность обнаруживается только в одной белковой фракции — в той, которая содержит димерную форму фермента. Фракция, соответствовавшая мономерной форме, была каталитически неактивна [142]. На основании этих данных авторы приходят к выводу, что мономер-
203
8*
ная форма фермента не может выполнять каталитическую функцию. Однако и такое заключение нельзя считать однозначным, учитывая более высокую лабильность субъединиц ‘по сравнению с нативной (димерной) формой тиаминовых ферментов.
Несколько сложнее обстоит дело с транскетолазой пекарских дрожжей. Для определения каталитической активности данного фермента он обычно добавляется в реакционную смесь в количестве нескольких микрограммов на 1 'мл. В то же время было показано, что даже при большей концентрации апотранскетолазы в растворе она в значительной степени, судя по данным седимен-тационного равновесия, присутствует в мономерной форме. При добавлении кофакторов сдвиг равновесия в сторону димера хотя и происходит, но лишь частично [2].
Здесь могут иметь место по меньшей мере три возможности:
1) каталитической активностью характеризуется только мономерная форма траискетолазы и именно она присутствует в растворе при низкой концентрации белка, независимо от того, есть в системе кофакторы или нет;
2) каталитическая активность присуща в равной степени как мономеру, так и димеру;
3) активна только димерная форма фермента, для образования которой из мономеров (в условиях низкой концентрации фермента) необходимо наличие в среде кофакторов. Частичный распад холофермеита на субъединицы в этих условиях можно было бы объяснить большей лабильностью субъединиц и неспособностью их после денатурации взаимодействовать с кофакторами. И как следствие — неспособность кофакторов переводить такие субъединицы в димерную форм\. Принципиальная возможность частично денатурированных субъединиц к ассоциации при этом могла бы сохраниться и реализовываться в условиях относительно высокой концентрации фермента, но без участия кофакторов.
