Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
196
Рис. 51. Хроматограф» ропанне препарата транс кетолазы на КМ-ссфадек-l-c |280] 0,3
Колонка уравновешен;) 4.5-¦ 1П-г М калнй-фосфатным й>-фором, pH 5,5; а — исходный препарат фермента; б—посте дробного фракционировании сульфатом аммония; я — что н б. но с последующим вы аерживанием в щелочном 10 Y и
растворе сульфата аммония 0,3 »¦
Обозначения, как иа рис. Ю ^
D.Z | §
OJ
после чего хроматографировать при тех же условиях, что и раньше, то свободная форма глицеральдегидфосфатде-гидрогеназы опять обнаруживается (см. рис. 51, в).
Повторяя описанную процедуру, можно получить ферментный препарат, вообще не содержащий глицс-ральдегпдфосфатдегндрогеназу и элюирующийся с колонки двумя пиками, соответствующими двум индивидуальным нзоформам транскетолазы (см. рис. И, я).
Таким образом, «связанная форма» глнцеральдггид-фосфатдегидрогеиазы—это та же свободная форма фермента, только находящаяся в комплексе с транскето-лазой. Под действием сульфата аммония при pH выше 7 она высвобождается из комплекса н может быть отделена от транскетолазы хроматографически (см. рис. 51) или дробным фракционированием сульфатом аммония. Именно это и позволяло получать однородные препараты транскетолазы, используя метод дробного фракционирования, когда еще не было известно о существовании комплекса. Собственно, этот же метод используется и в
197
настоящее время, только в него добавлено предварительное, до фракционирования, выдерживание ферментного препарата в щелочном растворе сульфата аммония.
Следует заметить, что комплекс с глицеральдегидфос-фатдегидрогеназой способна образовывать только одна из нзоформ транскетолазы — изоформа I. Изоформа II транскетолазы всегда присутствует в свободном виде [30]. В условиях проведения эксперимента, показанных на рис. 51, хроматографического разделения изоформы I транскетолазы и комплекса транскетолаза — глицераль-дегидфосфатдегидрогеназа не происходило. Они элюировались одним белковым пиком. И еще один факт—каталитическая активность глицеральдегидфосфатдегидро-геназы, связанной в комплексе с транскетолазой, значительно повышается при добавлении в систему сульфгид-рнльных соединений. Эффект с p-меркаитоэтанолом был выражен в несколько раз сильнее по сравнению с цисте-ином или восстановленным глутатионом [30]. После высвобождения из комплекса способность активироваться сульфгидрильными соединениями терялась. В процессе хранения она вновь восстанавливалась. Но в данном случае, в противоположность глицеральдегидфосфатде-гидрогеназе, связанной с транскетолазой, все сульфгид-рнльные соединения действовали с одинаковой эффективностью. В то же время наличие в системе р-меркап-тоэтанола никак не сказывалось на хроматографическом поведении ни свободной глицеральдегидфосфатдегидро-геназы, ни ее комплекса с транскетолазой.
Способность комплексироваться с другими ферментами свойственна не только транекетолазе, но и другому ферменту пентозного пути превращения углеводов — трансальдолазе [272] На основании собственных экспериментальных данных авторы указанной работы делают вывод, что в неочищенных ферментных препаратах нз дрожжей трансальдолаза находится в виде комплекса с транскетолазой. Существование такого комплекса интересно, помимо всего прочего, с той точки зрения, что позволяет объяснить давно полученные и парадоксальные, как тогда казалось, экспериментальные данные. Заключаются они в следующем [98, 387].
1 А также, очевидно, ферментам, не связанным с нентошым путем превращения углеводов [112, 153, 412].
198
При добавлении к фруктозо-6 фосфату двух высоко-очищенных ферментов — транскетолазы и трансальдола-зы — наблюдалось быстрое его исчезновение, причем сразу с максимальной скоростью. Одновременно накапливался седогептулозо-7-фосф it, что указывало на протекание двух реакций:
Фруктозо-G-фос рат +
Фруктозо—f-(>-фосфат
Глицеральде-гид 3-фосфа г
Траискетолаза ДСИЛУЛОЗО- -f ЭрИтрОЗО-,----------------5-фосфат 4 фосфат
Эри розо-4-фосфат
Трансальдолаза-» Седегептулозо —f- Глииераль-------------------7 фосфат дегид-3-фосфат
В сумме:
2-фрукт озо О-фосфаг Седогептулозо 7-фос1>ат -f- Ксилулозо-5-фосфат
Это подтвердилось при химическом анализе реакционной смеси в процессе расщепления фруктозо 6-фосфата в данной системе. Но для осуществления указанных реакций необходимо наличие в среде, кроме субстрата-донора (в данном случае его функцию выполнял фрук-тозо-6-фосфат), еще и субстратов-акцепторов: глицераль-дегид-3-фосфата — для транскетолазной реакции и эрит-розо-4-фосфата — для трансальдолазной реакции. Но их не было в исходной реакционной смеси. Не было также и других возможных субстратов-акцепторов, что было специально проверено. Кроме того, фруктозо 6 фосфат не подвергался никаким превращениям, если добавляли только транскетолазу или только трансальдолазу, что находится в полном соответствии со спецификой реакций, катализируемых данными ферментами.
