Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 1
Обмен радиоактивности между 14С-2-гликольальдегидом и фруктозо-6 (poapi том [135]
Вещество мкМ Радиоактив Удельная
ность. радиоак
имп/мнн тивность
Гликольальдегид (до инкубации) 11,0 14 000 1270
Фруктозо-6-фосфат (до инкубации) 10,5 0 0
Элюированные с колонки
фруктозо-С-фосфат 5,4 2500 4G3
гликольальдегид 4,8 1 10 040* -
эригрулоза 4.46J
* Величине представляет собой суммарную радиоактивность гликольальдегидв
н эритрулозы, так как эти компоненты в данных опытах не разделяли.
Анализ показал, что вся его радиоактивность сосредоточена в первом углеродном атоме; этого следовало ожидать, исходя из предположения о наличии обменной реакции между «активным гликольальдегидом», образую щимся из фруктозо-6-фосфата, и свободным гликольальдегидом, меченным во втором положении. Аналогичные результаты, подтверждающие наличие обменной реакции между «¦активным гликольальдегидом» и свободным гликольальдегидом, были получены в опытах с использованием нерадиоактивного гликольальдегида и меченного по углероду фруктозо-6-фосфата.
«Активный гликольальдегид» удалось выделить из инкубационной смеси, в состав которой входили соответст-
19
вующий субстрат и транскетолаза [133, 135, 231, 237]. Для этою применяли различные методы, такие, например, как осаждение этанолом, адсорбция на кальций-фосфатном геле, хроматография на колонке с фосфоцел-люлозой. При использовании в качестве субстрата транскетолазы фруктозо-6 фосфата эффективное разделение достигалось на смоле Дауэкс-1. Пропуская через такую колонку смесь после инкубации, собирали в растворе фермент, в то время как субстрат реакции (фруктозо-6 фосфат) оставался связанным со смолой. При использовании меченного по углероду фруктозо-6-фосфата часть радиоактивности обнаруживалась в растворе фермента. После депротеинизации и последующего хроматографирования на бумаге радиоактивность распределялась сле-дующим образом: в том районе, где должен находиться гликольальдегид — 68% радиоактивности; 4% находилось в пятне, которое соответствовало эрнтрулозе, и 28% относили за счет фруктозо-6 фосфата. Если к части радиоактивного фермента, полученного с колонки, добавить нерадноактнвный глнкопьальдегид, то указанное распределение метки менялось. Ее содержание в гли-кольальдегиде уменьшалось, а в эритрулозе — увеличивалось. Радиоактивность фруктозо-6-фосфата оставалась практически неизменной. Эти опыты наглядно демонстрируют образование гликольальдегид-ферментного комплекса и возможность его взаимодействия с одним из обычных акцепторов (свободным гликолевым альдегидом) с образованием типичного продукта транскето-лазной реакции (эритрулозы).
Аналогичные результаты были получены при использовании рибозо-5 фосфата в качестве акцептора гликольальдегида. Правда, в этом случае из-за недостатка материала не удалось точно идентифицировать продукт реакции — седогептулозо-7-фосфат.
Постулирование и экспериментальное подтверждение факта образования промежуточных «активных комплексов» в реакциях, катализируемых тиаминовыми ферментами, еще ничего не говорило о химизме самих реакций. Оставалось также неясным, каким образом происходит прикрепление альдегида к коферменту, какая из группировок или частей сложной молекулы тиамин-пирофосфата (/) непосредственно участвует в образовании этих «активных комплексов».
20
о о
Тиаишширофосф it (I)
Едва ли не нее возможные группы тиаминпирофосфа-та предполагались в качестве активных — и аминогруппа, расположенная в четвертом положении пиримидинового кольца, реагирующая, как полагали, с пнруватом с образованием шиффова основания [551], и четвертичный азот тиазоловой половины с участием окислителыю-восстанорительного механизма [330, 406], и сульфгид рильная форма кофермента, образующаяся при раскрытии тназолового кольца, и даже метиленовый мостик, соединяющий две гетероциклические системы [161, 261]. Ни одна из этих гипотез не получила экспериментального подтверждения ни на модельных системах, ни в опытах с ферментами.
м/\/СНг\й_______/СНз
II I 1 I
I I I
Н О- Сг
Н
4' -Окси-4'-дезаминотиаминпирофосфат (//)
N/\/Cf4N___/°Нз
H3C/5^N/N'NH2 ^ S/4-CHs—CH.—О— Р—О—Р—011
I о о
