Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
15
мента наблюдается интенсивный обмен между меченным по углероду формиатом и карбоксильной группой субстрата. Последующие стадии (или какая-либо одна из них) необратимы, так как в тех же условиях инкубации не происходило включения метки в пируват из меченных по углероду ацетил-фосфата или ацетил-КоЛ.
Формиат — непосредственный продукт ферментативной реакции, катализируемой пируват: формиатлиазой. С другой стороны, он не образуется в качестве промежуточного продукта в реакции, катализируемой пируват: ферридоксин оксидоредуктазой. Оба вышеуказанных фермента, осуществляющие фосфорокластическое расщепление пнрувата, найдены в микроорганизмах.
а-Кетоазовалериатдегидрогеназа, выделенная из Bacillus subtilis, катализирует окислительное декарбоксилирование а-кетокислот с разветвленной цепью, таких, как а-кетоизовалериановая, а-кетоизокапроновая и а-кето-р-метилвалериановая кислоты [368]:
R—COCOOH+Ko\-SH+11АД+ -» R—С—S-KoA+CO,+HАДН+Н+
Как и при окислительном декарбоксилировании а кето-кислот с неразветвленной цепью, продуктами реакции являются С02, восстановленный НАД и соответствующий ацил-КоА.
Ацетолактатсинтетаза катализирует конденсацию двух молекул пировнноградной кислоты с образованием а-ацетолактата:
2СН3СОСООН -» СН3СОСОН (СН3) СООН + С02.
Реакция идет таким образом, что вначале одна молекула пирувата декарбоксилируется, в результате чего образуется остаток ацетальдегида, связанный с тиаминпиро-фосфатом. Затем он конденсируется со второй молекулой субстрата с образованием ацетолактата. Акцептором дву углеродного остатка может служить не только пировпноградная кислота, но и а-кетомасляная. В этом случае образуется а-ацето-а-окснмасляная кислота. Фермент обнаружен в растениях [356] и у микроорга-
СН
R=\,
,сн—,
з
/
СН3
16
низмов [86, 117, 145, 197, 199, 321, 400, 431, 488, 520, 521, 525]
Продукты ацетолактатсинтетазной реакции — а аце-толакта г и а-ацето а-оксимасляная кислота — служат исходными субстратами для синтеза соответственно ва-лина и изолейцина [11].
Пируватдегидрогеназа (пируват: цитохром 6,-оксидо-редуктаза, КФ 1.2.2.2), флавинсодержащий фермент, катализирует в присутствии цитохрома 6, окислительное декарбоксилирование пирувата с образованием С02 и свободной уксусной кислоты:
СНдСОСООН + феррицитохром Ьх -*
-* СН3СООН + С02 + ферроцитохром bv
Выделена из мутантного штамма Е. coli [251].
Сульфоацстальдегид: сульфолиаза катализирует расщепление сульфоацетальдегида с образованием уксусной кислоты и сульфита [299]:
OHCCHiiSOg -» CHgCOO- -f SO”.
Фермент был выделен в гомогенном состоянии из бактерий, которые способны утилизировать таурин в качестве единственного источника углерода и азота [301]. Это пока единственный из известных тиаминовых ферментов, осуществляющий расщепление не —С—С-связи. Он характеризуется высокой степенью специфичности и действует только на сульфоацетальдегид — продукт дезаминирования таурина тауриндегидрогеназой [302].
На этом можно, по-видимому, закончить перечень отдельных представителей тиаминовых ферментов и краткую характеристику реакций, которые они катализируют, и перейти к рассмотрению их свойств.
Глава вторая
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ТИАМИНОВЫХ ФЕРМЕНТОВ
Как уже указывалось во введении, общим для тиаминовых ферментов является то, что при их действии происходит расщепление —С—С-связи. Часть молекулы субстрата отщепляется в свободном виде, а другая часть какое-то время находится в связанном с ферментом состоянии, образуя так называемую активную форму альдегида. В течение долгого времени представление об образовании таких активных промежуточных форм оставалось чисто умозрительным, хотя еще Нейберг [371, 373] указывал на возможность образования «активного ацетальдегида» в качестве промежуточного продукта простого декарбоксилирования пировнноградной кислоты. Подобные взгляды высказывались и для окислительного декарбоксилирования пирувата. По аналогии с этими реакциями предполагалось, что при каталитическом действии транскетолазы в качестве промежуточного продукта образуется «активный гликольальдегид» [246, 396].
Предположения об активных формах ацетальдегида и гликольальдегида основывались на том, что в свободном виде соответствующие альдегиды не обнаруживались ни при действий транскетолазы, ни в процессе окислительного декарбоксилирования пирувата, хотя, если исходить из характера реакций, они должны были бы образовываться в качестве промежуточных продуктов. Кроме того, свободные ацетальдегид и гликольальдегид или вообще не вовлекались в указанные реакции, или их превращение осуществлялось значительно медленнее по сравнению с исходными субстратами. Одно из первых подтверждении возможности существования «активного гликольальдегида» было получено в опытах по изучению
18
изотопного обмена между радиоактивным гликольаль-дегидом и нерадиоактивным фруктозо-С-фосфатом, поставленных в присутствии траискетолазы пекарских дрожжей [133, 135]. Опыты ставили следующим образом. Нерадиоактивный фруктозо-6-фосфат инкубировали с 14С-2-гликольальдегидом в присутствии траискетолазы. Затем смесь пропускали через ионообменную колонку для разделения углеводных компонентов, после чего измеряли нх общую и удельную радиоактивность. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, в процессе инкубации образуется меченый фру кто jo G-фосфат с довольно высокой удельной радиоактивностью.
