Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 31

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 86 >> Следующая

2. Кофермент полностью отщепляется в процессе выделения и очистки фермента: фосфокетолаза Lactobacillus plantarum [209], оксоглутаратдекарбоксилаза Mycobacterium phlei [557], пируватдекарбоксилаза зародышей пшеницы [478], пир>ватдегидрогеназные комплексы из Е coli [298], дрожжей Hansenula miso [226], сердца свиньи [204, 208, 269 293, 294, 548], мозга быка [48], грудной мышцы гол\бя [55, 56], пируватоксидаза из Lactobacillus Delbrueckii [196].
3. Тиамннпирофосфат частично отщепляется в процессе выделения и Очистки фермента: транскетолаза пивных [378] и лекарских [18 193] дрожжей, пируватдекарбоксилаза пивных дрожжей [516], фосфокетолаза Aceto-bacter xylinum [451], оксоглутаратдсгидрогеназные комплексы из пекарских дрожжей [225, 236] и сердца- свиньи [227, 293].
4. Фермент выделяется в виде холоэнзима: транскетолаза шпината [248, 250], печени крыс [249, 499] и свиньи [476], из эритроцитов человека [217, 218], пируватдегидро-геназный комплекс из мозга свиньи [475], оксоглутаратде-гидрогеназный комплекс грудной мышцы голубя [9].
88
Такое деление па группы в Достаточной мере условно, однако крайние состоянии разграничены довольно отчетливо. Трудно усмотреть какую-либо ясно выраженную закономерность в таком распределении по группам ферментов, выделенных из разных источников и катализирующих различные превращения разнообразных субстратов, тем не менее некоторые суждения сделать логично. Так, в первой группе 'Нет ферментов высших организмов, и наоборот, в четвертой отсутствуют ферменты, выделенные из микроорганизмов. Оксоглутаратдегидрогсназные комплексы животных тканей достаточно стабильны, в то время как от пнруватдегидрогеназных комплексов, полученных из тех же источников, кофермент отщепляется достаточно легко (исключение составляет только ли-руватдегидрогеназный комплекс из мозга свиньи), хотя оба близки по свойствам и катализируют один и тот же тип реакции — окислительное декарбоксилирование а-кетокислот. Прочность связи тиамннпирофосфата в транскетолазе варьирует в очень широких пределах: от очень лабильной в ферменте из Е. coli до очень стабильной в ферментах печени свиньи и эритроцитов человека.
Кофермент, не отщепившийся в процессе выделения фермента, можно отщепить одним из следующих способов: воздействие (переосаждение или диализ) щелочным раствором сульфата аммония [78, 179, 180, 193, 527], переосаждение или диализ при pH 4,5—6,5 [182, 246, 250, 392, 494], диализ против раствора ЭДТА [123, 339]. В некоторых случаях апофермент получали уже при диализе против глицил-глицинового буфера, pH 7,6 [378], или даже против воды [272].
Высокоочищенная транскетолаза из печени свиньи не требует для проявления максимальной ферментативной активности добавления извне тиаминпнрофосфата [476]. Потребность в коферменте не могла быть показана даже после диализа против 0,6%-ного раствора ЭДТА, проводившегося в течение 5 дней (условия для полного отщепления тиаминпнрофосфата от транскетолазы дрожжей). Так же прочно связан кофермент и с транскетола-зой, выделенной из эритроцитов человека [217].
Попытка отщепить тиаминпирофосфат от транскетолазы печени свиньи обработкой фермента сульфатом аммония в кислой среде, как это было сделано с транскето-лазой листьев шпината и печени крыс [250], сопровож-
89
далась полной денатурацией фермента [476]. При попытке отщепить кофакторы от пируватдегидрогеназного комплекса мозга свиньи также происходила почти полная потеря энзиматической активности [475]. Интересно заметить, что тот же фермент и тоже из мозговой ткани (только в данном случае — быка) полностью терял кофермент без всяких воздействий уже при нейтральных значениях pH [48].
Могут быть по меньшей мере две возможности для объяснения указанных экспериментальных данных. Либо кофермент прочно связан с белком (возможно, ковалентно) и не удаляется при использовании обычных методов, либо он отщепляется, но образующийся апофермент настолько лабилен, что тут же денатурирует, а так как степень отщепления определялась по разности активности, измеряемой с добавленными извне кофакторами и без них, то и создавалось впечатление, что кофермент не отщепляется.
В пользу второй возможности указывает то, что при условиях, когда тиаминпирофосфат отщепляется от других ферментов без существенного нарушения их нативной структуры, транскетолаза печени и пируватдегндро-геназный комплекс мозга свиньи денатурируют. Об этом же свидетельствуют и результаты, полученные с пируват-декарбоксилазой пекарских дрожжей [177]. Этот фермент частично диссоциирует на субъединицы уже при нейтральном значении pH. Одновременно происходит и отщепление тиаминпирофосфата. Оба процесса ускоряются при смещении pH в щелочную сторону и замене фосфатного буфера на трис-НС1 буфер. Отщепление кофермен-та и диссоциация на субъединицы обратимы, и в фосфатном буфере при низких значениях происходит реконструкция холофермента с восстановлением его исходных структурных и каталитических характеристик. Холофермент достаточно стабилен и не теряет активность в течение длительного времени. При отщеплении тиаминпирофосфата и распаде на субъединицы стабильность снижается, и через несколько часов нельзя ни восстановить активность, ни реассоциировать фермент из его субъединиц. Именно такой случай возможен для двух вышеуказанных ферментов — транскетолазы, выделенной из печени свиньи, и пируватдекарбоксилазы пируватдегидрогеназного комплекса мозга свиньи.
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed