Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
При использовании ферментных препаратов с различным содержанием в них апотранскетолазы (соответственно 85 и 40%) результаты оказались по существу аналогичные тем, что и при pH 7,6, только более однозначные. Наблюдалась ясно выраженная зависимость скорости фотоинактивации от количественного содержания апотранскетолазы в исходных препаратах. Степень же фотоинактивации по отношению к исходному количеству апотранскетолазы в том и другом случае была одна и та же (см. табл. 7). В полном соответствии с фотоинактивацией апофермента происходило увеличение относительного содержания холофермента в опытных пробах.
Каталитическая активность препаратов холотранскетолазы (апофермента в них содержалось менее 5%) в аналогичных условиях фотооблучення не менялась.
85
Таблица^7
Влияние исходной степени отщепления ^кофермента на*фотоинактивацшо тоанскетолазы (pH 6,0) [22\
Время Содержание, % Степень Содержание, % Степень
апофер холофер- апофер холофер-
мента Meitid мента мента
Контрольные пробы Опытные пробы
0 8.3 15 0 83 15 0
зо 83 13 48 70 30 58
0 40 00 0 40 60 0
зи 4U 60 22 20 80 59
0 5 У) и 3 УЗ 0
13 3 УЗ 0 3 93 0
Подводя итоги изучения материала, полученного при исследовании процесса фотоинактивации препаратов транскетолазы с различным содержанием в них холо-фермента, можно сказать, что функциональные группы (гистидин, судя по экспериментальным данным), разрушающиеся при фотоинактивации транскетолазы, входят в состав активного центра, участвуя, по видимому, во взаимодействии апофермента с тиаминпирофосфатом.
Теперь коснемся влияния субстратов на процесс фотоинактивации транскетолазы, о чем говорилось в начале настоящего раздела. Оно, по всей вероятности, неспецифическое. Аргументы в пользу этого следующие.
Во первых, при высокой (в несколько раз превышающей насыщающую) концентрации субстратов эффект защиты транскетолазы от фотоинактивации выражен крайне слабо (см. табл. 5). Во-вторых, при одной и той же концентрации фруктозо-6-фосфата и рибозо-5-фосфата в среде степень фотоинактивации снижается на одну и ту же величину. В то же время сродство их к ферменту неодинаково 1.134]; различны и их функции — один является субстратом-донором, а второй — субстратом-акцептором. И, наконец, точно такое же влияние, что и специфические субстраты транскетолазы, оказывает обычный фосфат (см. табл. 5).
86
Как будет показано «иже, оба фосфатных остатка тиаминпирофосфата необходимы для образования стабильной холотранскетолазы, а свободный фосфат конкурирует с коферментом за участок связывания на апофер-менте. Можно поэтому полагать, что при высокой концентрации субстраты (как и свободный фосфат) предохраняют транскетолазу от фотоинактивации, взаимодействуя неспецифически своим фосфатным остатком с функциональными группами активного центра, которые разрушаются при фотооблучении апофермента и которые специфически способны взаимодействовать с тиаминпирофосфатом.
Отсюда следует еще одно важное заключение о том, что функциональные группы, разрушающиеся при фотооблучении апотранскетолазы и специфически предохраняемые от разрушения тиаминпирофосфатом, в холо-транскетолазе связаны, по-видимому, с одной из фосфатных групп кофермента.
Подобные данные о вхождении остатка гистидина в состав активного центра и его участии в связывании тиаминпирофосфата были получены и для пируватдекарбоксилазы, изолированной из пируватдегидрогеназного комплекса грудной мышцы голубя [67]. Только в данном случае в качестве сенсибилизатора при фотооблучении вместо метиленового синего использовали бенгальский розовый. Полученные результаты были затем подтверждены в опытах, в которых в качестве модификатора остатков гистидина в ферменте использовали ди-этилпирокарбонат [54]. Экспериментальные данные, полученные с пируватдекарбоксилазой, выделенной из дрожжей, указывают на наличие остатка (или остатков) гистидина в активном центре и этого фермента [60].
Глава шестая КОФАКТОРЫ
ПРОЧНОСТЬ связи ТИАМИНПИРОФОСФАТА С БЕЛКОМ
Прочность связи тиаминпирофосфата с белком у разных ферментов неодинакова. По этому признаку все ти-аминовые ферменты можно разделить на четыре основные группы.
1. Связь кофермента с белком очень непрочная и уже в бесклеточном экстракте фермент находится в частично разобщенном состоянии. К этой грулпе относятся транс-кетолаза Е. coli [499], ацетоинобразующин фермент из Streptococcus feacalis [146], ацетолактатсинтетаза Е. coli [324], пируватоксидаза Proteus vulgaris [493].
