Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
В то же время известно, что из всех аминокислот, способных фотоокисляться, сильнее всего температ\ рная зависимость проявляется у тирозина. В том же температурном интервале, что и в опытах с транскетолазой, степень его фотоокисления уменьшается в 5 раз, а гистидина — только наполовину [541]. Считается, что аналогичная температурная зависимость сохраняется и для аминокислот, входящих в состав белковой молекулы [169, 542]
Таким образом, приведенные экспериментальные данные противоречат предположению о том, что повышение скорости фотоинактивации транскетолазы при высоких значениях pH обусловлено фотоокислением наряду с остатками гистидина также и остатков тирозина.
80
РОЛЬ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП ТРАНСКЕТОЛАЗЫ, РАЗРУШАЮЩИХСЯ ПРИ ЕЕ ФОТОИНАКТИВЛЦИИ
Функциональные группы транскетолазы, фотоокисление которых приводит к инактивации фермента, могут выполнять двоякую функцию: входить в состав активного центра или обеспечивать образование и поддержание нативной структуры фермента.
Из двух указанных возможностей предпочтение следует отдать первой. И вот почему. Как уже говорилось выше, фотоинактивация транскетолазы идет без образования частично инактивированных форм фермента. Фотоокисление одного остатка (или нескольких однотипных) приводит к полной потере ферментативной активности. Поэтому вероятнее всего он входит в состав активного центра транскетолазы. В пользу этого говорят и последующие экспериментальные данные, к рассмотрению которых мы сейчас переходим.
Фотоинактивация апотранскетолазы в присутствии субстратов
Как следует из данных табл. 5, смесь фосфопентоз, которая обычно используется в качестве субстрата при измерении транскетолазной активности, несколько снижает степень фотоинактивации транскетолазы. Эффект выражен слабо, несмотря на то, что концентрация фосфопен-
Таблица 5
Фотоинактивация тран кетолазы в присутствии различных
добавок \16\
Добавлено в фото- Концеи Степень фотоинакти Снижение степени
обл> чаемую пробу трвцня. вации. % от исходной фотоинактивации по
X10-* М активности • сравнению с пробой
без добавок %
- , 78
Смесь фосфопентоз 1,3 70 10
Рибозо-5-фосфат 7,0 55 30
Фруктозо-6-фосфат 7,0 Г) 7 28
Фосфат 7,0 56 28
• Время фотооблучения - - 30 мин; pH 7,6.
81
тоз — насыщающая для данного фермента. При повышении концентрации и использовании индивидуальных субстратов траискетолазы (рибозо-5-фосфата и фрукто-зо-6-фосфата) степень фотоинактивации траискетолазы снижается в несколько большей степени (см. табл. 5).
Заметим, что фосфат, взятый в той же концентрации, что и субстраты (7-10-2 М), вызывает снижение степени фотоинактнвации фермента примерно на те же 30% (см. табл. 5). Влияние ионной силы в данном случае исключается, что было показано в специальных опытах [24]. Не происходило и обесцвечивания метиленового синего, как это наблюдалось при добавлении в фотооблучасмые пробы 2 М хлористого калия [24]. Снижение степени фо-тоннактнвации траискетолазы в рассматриваемых опы тах было обусловлено наличием в среде ионов фосфата.
Влияние тиаминпирофосфата на фотоинактивацию траискетолазы
Свежевыделенные препараты траискетолазы в том случае, еспи фракционирование сульфатом аммония проводили при относительно низких значениях pH, показывают максимальную активность без добавления извне свободных кофакторов. Они не содержат апофермента. При хранении, а также при использовании для фракционирования щелочных растворов сульфата аммония количественное содержание холофермента в препаратах уменьшалось и составляло от 15 до 80%- Препараты, полученные обоими способами, использовали в настоящих экспериментах. Относительное содержание траискетолазы определяли по величине ферментативной активности, измеренной без добавления кофакторов, и относили ее к активности, измеряемой с добавлением тиаминпирофосфата и магния. Используя аналогичный принцип расчета, относительное содержание апофермента определяли по разности между активностями, измеренными с добавлением свободных кофакторов и без них.
В первой серии опытов фотооблучение осуществляли при pH 7,6—условии максимальной стабильности фермента. Как следует из данных, представленных на рис. 18 (кривые /), скорость фотоинактнвации траискетолазы в значительной степени зависит от содержания апофермента в исходном препарате: чем его больше, тем выше ско*
82
0 tf 30 0 /J 30 0 /J 30
Фшееблучеме, мии
Рис. 18. Фотоинактивация препаратов транскетолазы, содержавших различное количество аиофермента [22]
