Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Приведенные экспериментальные данные указывают на то, что две сульфгидрильные группы, существенные для активности, расположены вблизи активного центра. Связывание тиаминпирофосфата с апоферментом предохраняет их от блокирования и вызывает изменение конформации белка, в результате чего открываются две другие сульфгидрильные группы, несущественные для
71
активности. На том основании, Что Пируват не защищает пируватдекарбоксилазу Е. coli от инактивации л-мерку-рибензолсульфонатом, авторы [456] приходят к выводу, что сульфгидрильные группы не участвуют в связывании субстрата данным ферментом. Такой вывод нам кажется преждевременным потому, что, например, апопируват-декарбоксилаза из пивных дрожжей тоже не предохраняется пируватом от ингибирования сульфгидрильиыми реагентами, в то время как холофермент предохраняется полностью [433]. Защитное же действие пирувата по отношению к холопируватдекарбоксилазе Е. coli, судя по опубликованным данным, не исследовалось. Более того, для пируватдекарбоксилазы пивных дрожжей получены убедительные доказательства в пользу непосредственного взаимодействия субстрата с сульфгидрильной группой данного фермента, в резу чьтате чего образуется полу-меркапталь [439].
В пируватдекарбоксилазе, изолированной из пиру-ватдегидрогеназного комплекса грудной мышцы голубя, амперометрически и спектрофотометрически (по реакции с л-хлормеркурибензоатом) титруется 25—27 сульфгид-рильных групп [65]. Реакционность их неодинакова. Легко определяется 16—18 групп, в то время как связывание остальных осуществляется только при длительном выдерживании с реагентом. Скрытые сульфгидрильные группы, очевидно, отсутствуют, так как в присутствии
6—8 М мочевины определяется тоже 25—27 SH-rpynn.
Блокирование SH-групп сопровождается снижением ферментативной активности. Так, при связывании двух групп активность снижена на 17%. Степень ингибирования прямо пропорциональна количеству модифицированных SH-групп, и когда двадцать групп оказываются модифицированными — активность снижается до нуля. Таким образом, сохранение двадцати сульфгидрильных групп фермента необходимо для проявления полной каталитической активности пируватдекарбоксилазы.
Инактивация пируватдекарбоксилазы зависит не только от количества связанного сульфгидрильного реагента, но и от последующего времени выдерживания, в течение которого степень меркаптизации не изменяется (рис. 13). Таким образом, можно выделить две стадии инактивации фермента. Первая — быстрая, обусловлен ная блокированием SH-групп, и (вторая — медленная,
72
связанная с последующими изменениями в белковой молекуле. Необходимость модификации большого количества сульфгидрильных групп для достижения полного ингибирования, двустадийность процесса инактивации, а также уменьшение коэффициента седиментации и гетерогенность препаратов пируватдекарбоксилазы, обработанных п-хлор-меркурибензоатом [65, 464],— все это указывает на то, что SH-группы (по крайней мере, большая их часть) необходимы для поддержания нативной структуры данного фермента.
Ни пируват (субстрат пируватдекарбоксилазы), ни магний не влияли на результаты титрования SH-групп. Количество их, определенное мето дом амперометрического титрования, однако, снижалось в присутствии кофермента, и при его концентрации, равной 4 -10-3 М, сульфгидрильные группы не обнаруживались. Фермент при этом показывал полную активность.
Здесь могут быть две возможности.
1. Кофермент неспецифически взаимодействует с SII-группами, предохраняя их от меркаптизации, а фермент от инактивации (хотя в модельных опытах с глютатио-ном это не подтвердилось: количество титруемых сульфгидрильных групп при добавлении тиаминпирофосфата не изменялось [65]).
2. Изменение конформации белковой молекулы в результате специфического связывания кофермента в активном центре пируватдекарбоксилазы. Именно эта возможность предполагается самими авторами [65, 464]. Действительно, изменения конформации при образовании холоэнзима показаны для ряда тиаминовых ферментов, но они столь незначительны, что, почвидимому, захватывают только ограниченный участок белковой моле-
пхмб/пдк, моль!моль
Рис. 13. Влияние я-хлормер-курнбензоата на активность пируватдекарбоксилазы, изолированной из пируватдегид-рогеназного комплекса грудной мышцы голубя [651
Время преинкубации фермента с ПХМБ: I — 2 мии; 2 — 20 мин; 3 —24 ч
73
кулы и вряд ли могут обеспечить существенное изменение реакционноспособности всех сульфгидрильных групп фермента, тем более, когда их так много, как в рассматриваемом случае.
Пируватдекарбоксилаза, изолированная из пируват-дегидрогеназпого комплекса сердечной мышцы свиньи, содержит 27—36 сульфгидрильных групп на молекулу белка. Фермент ингибировался органическими соединениями ртути. Предварительная инкубация с тиаминпнро-фосфатом и пируватом значительно снижала степень ингибирования [294]. Отсутствие опубликованных экспериментальных данных не позволяет сравнить эти результаты с результатами, полученными с пируватдекарбоксила-зой грудной мышцы голубя.
