Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Киршвинк Дж. -> "Биогенный магнетит и магниторецепция. Новое о биомагнетизме. Том 1" -> 103

Биогенный магнетит и магниторецепция. Новое о биомагнетизме. Том 1 - Киршвинк Дж.

Киршвинк Дж., Джонса Д. Биогенный магнетит и магниторецепция. Новое о биомагнетизме. Том 1 — М.: Мир, 1989. — 353 c.
ISBN 5-03-001274-5
Скачать (прямая ссылка): biogenniymagnetit1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 150 >> Следующая

в течение 30 мин при комнатной температуре, промывают в буфере, освобождают от иголочек, прикрепляющих ее к воску, и погружают в свежеприготовленную смесь равных частей 0,5%-ной НС1 и 0,5%-ного ферроцианида калия. Эти исходные растворы готовят заранее в больших количествах и хранят в течение длительного времени. Перед смешиванием порции исходных растворов нагревают до температуры ~ 60°С и прокрашивание также проводят при этой температуре (в термостате). Через 15 мин ткань вынимают из красителя и промывают в буфере. Если окраска недостаточно интенсивна, процедуру окрашивания повторяют, используя свежесмешанный раствор. Не рекомендуется использовать красящую смесь больше 15 мин, поскольку она теряет свою окрашивающую способность и может вызвать артефактные осадки. Эти осадки имеют вид плотных нерегулярно расположенных голубых отложений на поверхности срезов и часто маскируют расположенные под ними структуры.
Окрашенный кусочек ткани исследуют и фотографируют. Клетки, содержащие железо и оксиды железа, выглядят голубыми, а другие ткани остаются неокрашенными. Затем можно обезводить ткань проводкой через спиртовые растворы, просветлить в ксилоле и заключить в заливочную среду для изготовления срезов. Процедура заливки-обычная; она детально описана во многих методических руководствах (например, Humason, 1967).
Тотальные препараты показывают, какие ткани содержат железо, но дают очень мало информации о том, в каком состоянии находится железо и каковы особенности клеток, связанных с железом. В частности, с помощью этой методики нельзя ответить на вопрос, вне- или внутри-клеточно расположено железо. Поэтому ткань следует порезать и исследовать в световом микроскопе, предварительно заключив ее в заливочную среду. В качестве заливочной среды можно использовать парафин или гликол-метакрилат (пластмасса JB-4, DuPont /Sorval или Polysciences). Поскольку большинство тканей, с которыми мы работали, имели большой диапазон твердости-от кости до нервной ткани,-мы использовали чаще более твердую пластмассу, а не парафин. При этом сохраняется целостность ткани, а кость режется так же хорошо, как более мягкая окружающая ткань. Процедуру заливки проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя, за исключением того, что в некоторых партиях пластмассы требовалось меньшее количество отвердителя, чем было рекомендовано, поскольку в противном случае пластмасса затвердевала слишком быстро и заливка была недоброкачественной. Свеже-изготовленными стеклянными ножами могли резать относительно крупные куски ткани (до 1,0 х 1,5 см). Эти ножи делали из стекла толщиной 3/8 или 1 /2 дюйма (9,51 и 12,7 мм) при помощи ножеизготовителя типа LKB или DuPont /Sorval. Срезы толщиной 3 мкм, изготовленные при помощи микротома JB-4, помещали для разглаживания на поверхность воды в водяную баню, переносили на предметные стекла, высушивали и обрабатывали соответствующим образом. Если ткань была предварительно окрашена, то срезы можно было накрывать покровными стеклами и
начинать их исследование. Если ткань не была окрашена, то производили следующие операции. Срезы нагревали до 60°С и вновь смачивали погружением в горячую дистиллированную воду. Эта процедура необходима, поскольку при окрашивании применяли стеклянные штативы, которые для предотвращения растрескивания следовало нагревать перед помещением в горячий красящий раствор. Стекла с препаратами обрабатывали в течение 15 мин свежеприготовленным горячим кислым раствором ферроцианида калия, затем промывали дистиллированной водой и подкрашивали контрастирующим красителем Кернехтрота. Он состоит из 5%-ного раствора ядерного быстрого красного в дистиллированной воде. Срезы обрабатывали красителем в течение 30 мин при 60°С, промывали дистиллированной водой, обезвоживали сначала в серии спиртов, а затем в ксилоле и закрывали покровным стеклом.
При наблюдении в световой микроскоп ткань благодаря контрастирующему красителю выглядит красной, а включения железа - интенсивно синими. Если все операции проводят очень тщательно (используют бидистиллят, очищают все стекла, сосуды для окрашивания и т. д.), то поверхностных артефактов мало. Поскольку железо-широко распространенный элемент и у позвоночных оно участвует в дыхании, его выявление в данной ткани еще не означает, что оно всегда в ней имеется. Очевидно, если железо участвует в сенсорном процессе, то оно должно всегда присутствовать в магниторецепторной системе. Исходя из этого, мы установили следующий критерий положительного окрашивания на железо. Окрашивание должно обнаруживаться в одних и тех же клетках, по крайней мере в десяти последовательных срезах, и в одних и тех же клетках определенной ткани по меньшей мере у пяти различных животных. Позитивное окрашивание при использовании этой методики не доказывает, что обнаружен магнетит, но оно свидетельствует о присутствии железа и его локализации в ткани. Железо, связанное с белками, например в гемоглобине или цитохромных ферментах, никогда не окрашивается. Этот вывод был сделан при попытке окрасить эритроциты голубя или митохондрии в исследуемых тканях. Частицы магнетита окрашиваются так же, как и любые сплавы металлического железа, поэтому в процессе препарирования и окрашивания тканей нельзя использовать никакие инструменты, содержащие железо. Мы наблюдали окрашивание селезенки голубя, которая содержит железо, отщепившееся от гемоглобина. У пчелы (Kuterbach et al., 1982), большая часть железных гранул представлена гидратом оксида железа, например в составе ферритина, и интенсивно окрашивается. Итак, окрашивание ферроцианидом калия является первым шагом при изучении железосодержащих тканей. Эта методика показывает, какие ткани и клетки содержат железо, а также позволяет установить, распределено ли оно диффузно или присутствует в виде гранул.
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 150 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed