Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Руководство по капилярному электрофорезу
Автор: Энгельгард Х.Издательство: Москва
Год издания: 1996
Страницы: 112
Читать: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130
Скачать:
Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.
В книге детально описана современная аппаратура, изложены практические приемы постановки экспериментов, проанализировано влияние на их результаты различных физико-химических параметров. Рассмотрены все варианты и модификации описываемых методов. Даны ссылки на оригинальные экспериментальные работы, опубликованные в ведущих журналах мира по декабрь 1980 г.
Книга рассчитана на биохимиков, медиков, фармакологов, работников пищевой промышленности.
Табл. 4, илл. 77, библиогр. 294 назв.
Ответственный редактор
член-корреспондент АН СССР Г. П. ГЕОРГИЕВ
О1П05___414
684—82 Кн. 2.2001040000 © Издательство «Наука», 1981
Часть первая
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
ВВЕДЕНИЕ
Электрофорез занимает сейчас центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии фракционирования или характеристики этих биополимеров не был использован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.
Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала (рис. 1, справа).
На рисунке, помимо рабочего канала (трубки), показаны некоторые необходимые компоненты системы. Во-первых, это два электрода, представленные спиральками из платиновой проволоки, а во-вторых, электродные резервуары. Через находящиеся в ни* буферные растворы и рабочий канал замыкается электрическая цепь между электродами.
Рабочий канал не случайно заштрихован. Дело не только в том, что, будь он просто заполнен жидкостью, изображенная
схема выглядела бы нелепо, так как буфер из трубки и верхнего резервуара должен был вылиться в нижний. Эту трудность можно обойти, если придать каналу с жидкостью U-образную форму. Такие приборы использовались на первых этапах развития метода (электрофорез в свободной жидкости); Хуже другое: в жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны. Поэтому в современных приборах рабочий канал заполняют гелем, что на схеме изображено штриховкой. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая (гидрофильная) пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Вместе с тем используемые гели содержат очень много жидкости (80—99,5%), в которой (т. е. в рабочем буфере) и мигри-(+) РУЮТ макромолекулы. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбеж-
Рис. 1. Схема простейшего прибо- но сталкиваются с нитями полира для электрофореза в геле мера, образующего сетку геля,
а — до начала фракционирования, б— ЧТО увеличивает Эффективное
после pm окончания трение о среду, а следовательно,
снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится.
В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели (ГТААГ) и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации pH буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость.
