Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 96

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 90 91 92 93 94 95 < 96 > 97 98 99 100 101 102 .. 115 >> Следующая

Ат-}-Аг*--АтАг (9.30)
ft-i
После установления равновесия несвязавшиеся с антителами компоненты удаляют чаще всего путем промывания носителя с иммобилизованными антителами. В процессе промывки часть связавшегося антигена может диссоциировать и удаляться из системы. Количество адсорбированного антигена пропорционально времени
246
контакта промывающего раствора с сорбентом, из чего следует, Что отмывку следует проводить по возможности быстро.
На второй стадии к иммобилизованному комплексу антитело — антиген добавляют раствор, содержащий меченные ферментом антитела, после чего становится вероятным прохождение следующих процессов:
1) диссоциация связавшегося антигена в раствор:
*—1
АтАг Ат-f Аг (9.31)
k j
2) связывания меченых антител с антигеном в специфическом комплексе на носителе:
ft»
АтАг-|-Ат*«---АтАгАт* (9.32)
*—2
3) диссоциация образовавшегося комплекса по связи с первыми антителами:
й-з
АтАгАт*^тгг-- Ат-|-АгАт* (9.33)
4) связывание отделившегося комплекса (АгАт*) в растворе с мечеными антителами:
ft,
АгАт*-|-Ат* -<--- Ат*АгАт* (9.34)
ft-.4
5) взаимодействие связавшегося на первой стадии, а затем перешедшего в раствор антигена с мечеными антителами:
*5
Аг + Ат*-—- АгАт* (9.35)
*-5
Данные процессы описываются следующей системой уравнений:
? dtATAl^ [Ат] [Аг]-{-&-2 [АтАгАт*] — ]; [АтАг] — dt
~ ?2[АтАг][Ат*] (9.36)
?1АтАгАт*]__^ |АтАг| [Ат*] +fcl Ат] [АгАт*] -dt
— (А_2-)-А_з)[АтАгАт*] (9.37)
[Ат*АгАт*] = ^ [АгАх*] [Ат*] _ й_4 [Ат*АгАт*] (9.38)
dt
— ^ = ^5 [Ат*] [Аг] -f-k-z [АтАгАт*] [Ат*АгАт*] —
247
— k-5 [АгАт*] — &4 [АгАт*] [Ат*] — k3 [АгАт*] [Ат] (9.39)
[Аг]0 = [Аг] -[-[АтАг] -(-[ Ат*Аг]-[- [Ат*АгАт] -{- [Ат*АгАт*] (9.40)
где [Ат*]0 — начальная концентрация меченых антител, [Аг]0 — концентрация определяемого антигена, связанного с иммобилизованными антителами после отмывки носителя.
В начальный момент времени на второй стадии [Аг]=0; [Ат*Аг]=[Ат*АгАт]=[Ат*АгАт*]=0.
Приведем в качестве иллюстраций теоретические графики, полученные путем точного решения данной системы уравнения на
При наличии антител данной аффинности и необходимости определять антиген в фиксированном диапазоне концентраций величинами, которые может варьировать экспериментатор, являются концентрации иммобилизованных и меченых антител и времена инкубации на первой и второй стадиях.
Как отмечалось выше, на первой стадии целесообразно проводить реакцию в равновесном режиме, выбирая максимально возможную концентрацию антител, не приводящую к значительному увеличению вклада неспецифических взаимодействий. (Отметим, что в ряде модификаций ИФА концентрация антител не может варьироваться в широких пределах. Например, при использовании в качестве сорбента полистирольных планшетов или пробирок эта величина лимитируется площадью поверхности носителя.)
Больший интерес представляет рассмотрение второй стадии.
Длительность реакции с мечеными антителами. После удаления несвязавшегося антигена и добавления меченых антител равновесие, установившееся на первой стадии, смещается и происходит диссоциация комплекса антитело — антиген. Наибольшая степень диссоциации, очевидно, будет иметь место при значениях [Аг]о, приводящих к образованию специфического комплекса в концентрации, приближающейся к начальной концентрации антител, т. е. влияние диссоциации будет сильнее сказываться в правой части калибровочного графика. Кроме того, степень диссоциации зависит от соотношения концентрации и константы связывания антител. Например, при значении /С«1/[Ат]0 и при [Аг]0«[Ат]о после диссоциации в связанном с антителами состоянии остается примерно половина первоначально образовавшегося комплекса антигена ([Аг]0/2). При /С»1/[Ат]0 влияние процесса диссоциации будет пренебрежимо мало. Но при работе в диапазоне I/JAtJo^AT время инкубации может значительно влиять на концентрацию молекул меченых антител, связавшихся в комплекс АтАгАт*, т. е. в конечном итоге на регистрируемый в ИФА сигнал. Иллюстрирую-
[Ат]0=[Ат] -J- [Ат Аг] + [АтАгАт*]
[Ат*]0 = [Ат*]-[-[Ат*Аг]-[-[Ат*АгАт] -[-[Ат*АгАт*]
(9.41)
(9.42)
ЭВМ.
248
щая это положение теоретическая зависимость приведена на рис. 45.
При увеличении времени инкубации концентрация связанных меченых молекул сначала возрастает, а затем резко снижается. Эффект снижения может быть вызван тем, что продиссоциировав-ший из комплекса антиген связывается избытком меченых антител, что сдвигает равновесие в сторону дальнейшей диссоциации (отметим, что при выбранных начальных условиях степень заполнения антител антигеном на первой стадии близка к 100%- При меньших степенях заполнения эффект будет менее резко выражен). При данных условиях требуется строгая оптимизация длительности второй стадии анализа. Общей рекомендацией в подобном случае является уменьшение времени до при котором влияние процесса диссоциации будет незначительно.
Рис. 45. Теоретическая зависимость образования тройного комплекса в «сэндвич»-методе от длительности инкубации с мечеными антителами: [Ат]0=О,1 иМ; fArIo=0,l нМ;
=3 иМ; fci = fc,* = 10e /е_,-
Предыдущая << 1 .. 90 91 92 93 94 95 < 96 > 97 98 99 100 101 102 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed