Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 94

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 115 >> Следующая

\ Время инкубации. Скорость связывания в каждый момент вре-мдаи пропорциональна концентрации свободных центров связывания антител. Поэтому наилучшее соответствие кривой титрования и калибровочной кривой (т. е. соблюдение условия строгой пропорциональности между концентрациями связанного меченого антигена и свободных центров связывания) должно достигаться при
а [Аг]0,нМ 5 [Аг]0,нМ
Рис. 40. Теоретические кривые титрования (/) и калибровочные графики (2), полученные при временах проведения второй стадии ИФА по методу последовательного насыщения ^=10 мин (о) и / = 2 ч (б):
[Ат]0=0,2 нМ, [Аг*]0=1 нМ; ^=**, = 5-10-5 М-1 • с-1; *,=**_1 = 10—4 с-1
крайне малом времени проведения реакции. При возрастании времени инкубации пропорциональность может существенно ухудшаться прежде всего за счет диссоциации образовавшегося на первой стадии специфического комплекса. С наибольшей силой этот эффект должен проявляться в правой части калибровочного графика, где на первой стадии достигается значительное заполнение центров связывания. Образование свободных центров связывания вследствие диссоциации в концентрации &_i/[At]0 (в линейном приближении) должно приводить к сдвигу правой части калибровочного графика вверх относительно кривой титрования за счет связывания меченого антигена с освободившимися центрами. Для нивелирования этого эффекта достаточно, чтобы количество образующихся таким образом свободных центров связывания не превышало величину порядка 10% от [Ат]0, для чего время прове-
241
дения второй стадии следует выдерживать примерно /^0,1/&и. На рис. 40 приведена графическая иллюстрация этого положения. Из рисунка следует, что при правильном выборе длительности инкубации с меченым антигеном калибровочный график и кривая титрования в нормированных координатах практически совпадают.
Рис. 41. Экспериментальные (о) н теоретические (б) калибровочные графики определения инсулина:
время инкубации с меченым антигеном для кривых / — 4 соотвегствеино равно 5, 10, 20, 80 мин; теоретические кривые построены при следующих значениях: [Ат]0=0,3 нМ; [Аг*]0=1 нМ; 5 ? 105 М-1-с-l; k_x=k*_x =
= 10-4 С-»
На рис. 41 приведены теоретические и экспериментальные калибровочные графики определения инсулина, полученные при различных временах инкубации с меченым антигеном. Из сравнения теоретических кривых, полученных при значении &_i = 10-4 с-1 (0,l/^_i» 17 мин), следует, что при увеличении времени проведения второй стадии существенно выше 15 мин (кривые 3, 4) отношение между значениями ординат, соответствующими минимальной и максимальной концентрациям определяемого антигена, стремится к единице, что делает невозможным проведение анализа. Экспериментальные зависимости удовлетворительно коррелируют с теоретическими, что дает основание использовать расчетные данные для оптимизации реальной аналитической системы.
Концентрация меченого антигена. Практическим критерием выбора концентрации меченого антигена является возможность до-
[Ai-Ar*], нМ
0,5 1,0
а Ш„,нИ
0,5- ifi
j 1Аг]В1нМ
242
северной регистрации сигнала от метки, связавшейся с антителами. При выполнении этого условия концентрация [Аг*]д в метода последовательного насыщения не является строго ограниченно^. Однако возможны случаи, когда выбор неоптимального значения [Аг*]0 может существенно отражаться на результатах анализа. Допустим, что в опыте используются поликлональные антитела, молекулы которых обладают различным сродством к антигену (такие антитела могут быть экспериментально разделены на высоко- и низкоаффинную фракции, для которых известны концентрации и константы связывания).
Рис. 42. Теоретические калибровочные графики для гетерогенной популяции антител:
[Аг*]0 для кривых (а) и (6) соответственно равны 1 и 10 нМ; популяция антител с общей концентрацией [Ат]о—0,3 нМ считается состоящей иа 30% из высокоаффинных связывающих центров (/ji10е М— ‘«с—*; &_i=6*_i = 10—4 с—*) и на 70% из низкоаффинных (fti** “=&!* = 105 М—,*с—1; А_1*= А*_| = 10—3 с—1); врем*я f = 10 мин
Если значения концентраций и констант связывания двух функций антител значительно отличаются, то возрастание [Аг*]о может приводить к возрастанию фонового сигнала, что проявляется в сдвиге правой части калибровочного графика вверх по ординате. Это объясняется тем, что при достижении полного заполнения высокоаффинных центров связывания дальнейшее возрастание [Аг*]0 ведет к увеличению связывания конъюгата только с низкоаффинной фракцией, дающей вклад в калибровочную кривую в виде практически не меняющегося в необходимом диапазоне концентраций [Аг]0 сигнала. Расчетные кривые приведены на рис. 42. Для получения теоретической иллюстрации этого эффекта в модель были введены соответствующие усложнения, позволяющие считать популяцию антител состоящей из двух фракций с различным сродством к антигену.
243
Аналогичный эффект наблюдается и при наличии процесса неспецифического взаимодействия, который обусловлен связыванием меченого антигена избытком центров, обладающих меньшей константой связывания, чем антитела. Для подавления роста вклада неспецифического связывания (или влияния низкоаффинных антител) можно рекомендовать использовать в анализе концентрацию меченого антигена, при которой связывающие центры антител заполняются не более чем на 60—70% или, в линейном приближении, [Аг*]о^ l/(?i*T) (при выбранном оптимальном времени Т).
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed